原發(fā)性肝細(xì)胞癌細(xì)胞系和組織中ARID2的表達(dá)*

姬旭慧，張 玲，張江波，陳丹丹，劉 媛，魯鳳民，呂全軍#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)河南省腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科 鄭州 450008 3)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100191

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]。目前認(rèn)為，抑癌基因的功能缺失和致癌基因的激活與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，但其分子機(jī)制尚未完全闡明[3]。染色質(zhì)重塑基因ARID2位于人體12號(hào)染色體。最近的研究[4]發(fā)現(xiàn)ARID2在肝癌存在一定頻率的突變，被認(rèn)為是一個(gè)與肝癌相關(guān)的腫瘤抑制基因。作者檢測(cè)了ARID2 mRNA在正常肝組織、不同肝癌細(xì)胞系、不同感染背景的肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，嘗試分析其表達(dá)的影響因素。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源收集河南省腫瘤醫(yī)院2009年5月至2010年4月臨床診斷為HCC并手術(shù)切除的標(biāo)本105例，85例有HBV感染，20例無(wú)HBV或HCV感染，取其癌組織及配對(duì)癌旁正常組織(距離病變2 cm)。7例對(duì)照肝組織取自肝臟良性病變男性患者。取材均經(jīng)患者同意。標(biāo)本離體后立即取材，于0.5 h內(nèi)凍存于液氮內(nèi)。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診，患者術(shù)前未接受過(guò)放化療。

1.2細(xì)胞、試劑和儀器9種肝癌細(xì)胞系HepG2、SNU182、Huh-7、PLC/PRF/5、SNU449、SK-Hep-1、SNU387、SMMC7721和Hep3B均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系提供。Trizol試劑(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master(德國(guó)Roche公司)， RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)GibcoBRL公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)羅氏公司)。

1.3ARID2的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增體系20 μL，其中羅氏Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水8 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，84 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃10 min延伸。每個(gè)樣本兩個(gè)平行樣，取平均CT值。以CTBP為內(nèi)參計(jì)算目的基因表達(dá)水平[5]。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR擴(kuò)增基因引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 12.0分析，采用配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析癌組織和癌旁組織ARID2 mRNA的表達(dá)差異。定義癌組織與癌旁組織中ARID2 mRNA表達(dá)水平的比值<0.5為低差異表達(dá)，>2為高差異表達(dá)，介于0.5～2之間為無(wú)差異表達(dá)。不同感染背景的HCC組織ARID2 mRNA表達(dá)的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 9種HCC細(xì)胞中ARID2mRNA的表達(dá)有HBV感染背景的5種HCC細(xì)胞(HepG2、SNU182、SNU387、SNU449、Hep3B)中ARID2 mRNA的表達(dá)水平為0.5(0.2～0.7)，無(wú)HBV感染背景的4 種HCC細(xì)胞(Huh-7、PLC/PRF/5、SMMC7721、SK-Hep-1)中的表達(dá)水平為3.8(2.2～9.7)。

2.2HCC組織中ARID2mRNA的表達(dá)有HBV感染的癌旁正常組織ARID2 mRNA的表達(dá)水平為0.5(0.2～0.7)，無(wú)HBV感染的癌旁正常組織ARID2 mRNA的表達(dá)水平為0.3(0.2～0.6)，2者均高于正常肝組織ARID2 mRNA的表達(dá)[1.2(1.1～1.6)](Z=10.684和16.015，P=0.005和0.003)。癌組織和癌旁組織中ARID2 mRNA表達(dá)的比較見(jiàn)表2。不同感染背景的HCC組織中ARID2 mRNA表達(dá)的比較見(jiàn)表3。

表2 癌組織和癌旁組織中ARID2 mRNA的表達(dá)

表3 不同感染背景的HCC組織中ARID2 mRNA表達(dá)差異的比較 例

Z=13.479,P<0.001。

3 討論

目前對(duì)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷與治療存在諸多難點(diǎn)，探索新的生物標(biāo)志物為研究熱點(diǎn)[6]。ARID2作為抑癌基因[6]，已被證實(shí)在多種腫瘤組織中存在突變。研究[5]發(fā)現(xiàn)ARID2在非小細(xì)胞型肺癌組織中的突變率為5%，屬于高頻突變基因。Li等[7]發(fā)現(xiàn)43例無(wú)HCV感染背景的HCC患者基因組中ARID2失活性突變率高達(dá)14%。但在有HBV感染背景的HCC，ARID2的突變率僅為0.9～2.0%[5]，提示在有HBV感染的HCC中ARID2的突變可能不是導(dǎo)致其作用被抑制的主要原因。該研究中ARID2 mRNA在正常肝組織和HCC癌旁組織的差異提示其發(fā)揮抑癌作用可能為早期事件。不同感染背景下的HCC細(xì)胞系A(chǔ)RID2 mRNA表達(dá)水平不同，有無(wú)HBV感染背景的HCC組織中ARID2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在不同感染背景下ARID2參與HCC發(fā)生發(fā)展的通路與機(jī)制可能不同。

研究[8]顯示：ARID2存在于PBAF復(fù)合物中，作為穩(wěn)定SWI/SNF染色體重組復(fù)合物的必要因子，通過(guò)參與染色體重塑來(lái)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。ARID2在HCC發(fā)生發(fā)展中可能通過(guò)染色體重塑的機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，具體作用和機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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