碳青霉稀類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制和多位點(diǎn)序列分型研究

彭乃杰， 林哈妮， 夏 菲， 李克誠(chéng)， 張 青， 葛少紅

(瑞安市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江瑞安325200)

碳青霉烯類抗菌藥物被認(rèn)為是為數(shù)不多的可有效治療高產(chǎn) AmpC酶和超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)多重耐藥菌引起的嚴(yán)重感染的藥物之一。然而，隨著碳青霉烯類藥物在臨床中的大量、廣泛應(yīng)用，碳青酶烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌不斷增加。其機(jī)制主要是細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶能夠水解碳青霉稀類抗生素。肺炎克雷伯菌產(chǎn)生碳青霉烯酶主要為產(chǎn)KPC酶。KPC是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的Ambler分類B類酶，能水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉稀類抗菌藥物。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)通過(guò)測(cè)序來(lái)揭示保守基因的等位基因突變來(lái)對(duì)病原菌進(jìn)行分型和鑒定。由于不同實(shí)驗(yàn)室能通過(guò)網(wǎng)絡(luò)與基于核苷酸的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，且基于DNA的模式能更好的反應(yīng)菌株間的遺傳變異情況，使得MLST技術(shù)在了解流行病學(xué)特征、病原菌的傳播途徑、追溯傳染源及臨床傳染性疾病診斷中發(fā)揮了重要作用。

由于本地區(qū)尚缺乏碳青霉稀類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制和分子流行病學(xué)資料。因此，我們使用MLST和Minimum spanning trees分析研究本地區(qū)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌基因特征和遺傳性質(zhì)。

一、材料和方法

1.菌株來(lái)源 收集瑞安人民醫(yī)院2010年1月至12月臨床分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌8株。

2.儀器與試劑 Vitek2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)及其配套的鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司)，E-test試條(瑞典AB BIODISK公司產(chǎn)品)。

3.菌株鑒定 分離純化菌株，采用Vitek2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)及其配套的鑒定卡。

4.體外藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦紙片擴(kuò)散法，藥敏紙片(頭孢唑啉、頭孢西丁、亞胺培南、阿米卡星、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢哌酮-舒巴坦、美洛培南、慶大霉素、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、頭孢吡肟、頭孢噻肟)由英國(guó)OXOID公司提供。

5.E-test藥敏試驗(yàn) 將0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊膶?shí)驗(yàn)菌株分別均勻涂布于M-H瓊脂平板上，于平板上貼亞胺培南、美羅培南E-test藥敏紙片。根據(jù)CLSI 2010年6月更新的準(zhǔn)則判斷結(jié)果。

4.改良Hodge試驗(yàn) 將0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊拇竽c埃希菌(ATCC25922)均勻涂布于M-H瓊脂平板上，再將10μg/片亞胺培南紙片貼于平板的中間，將實(shí)驗(yàn)菌株分別以亞胺培南紙片為起點(diǎn)，沿離心方向劃線，35℃培養(yǎng)過(guò)夜，抑菌圈內(nèi)呈矢狀者為陽(yáng)性，并設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

5.PCR擴(kuò)增及測(cè)序 煮沸裂解法提取實(shí)驗(yàn)菌株全基因，用引物KPC-F(5'-GCTACACCTAGC TCCACCTTC-3')、KPC-R(5'-GCATGGATTACCAAC CACTGT-5')擴(kuò)增blaKPC基因。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序部雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST比對(duì)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

6.MLST分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB)參照http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/primersKpneum oniae.html公布的通用引物及退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，將序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存的序列比對(duì)，確定其等位基因譜型及菌株序列型(ST型)。利用官方提供的工具生成Minimum spanning trees。

二、結(jié)果

1.菌株鑒定 采用Vitek2全自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定實(shí)驗(yàn)菌株均為肺炎克雷伯菌。

2.K-B藥敏試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)菌株臨床常規(guī)藥物敏感實(shí)驗(yàn)均為耐藥。

3.E-test藥敏試驗(yàn) 用E-test藥敏試驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定，顯示所有菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南耐藥，MIC均＞32 mg/L。

4.改良Hodge試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)菌株Hodge試驗(yàn)均陽(yáng)性。

5.PCR擴(kuò)增及測(cè)序 用KPC引物擴(kuò)增并電泳可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)菌株均有1條1 000 bp左右的條帶，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)均為KPC-2。

圖1 bla KPC PCR產(chǎn)物

6.MLST分析 MLST顯示有4種ST型，流行型為ST-11(5/8)，此外 ST-494、ST-15、ST-258各1株，見(jiàn)表1。

表1 MLST和KPC結(jié)果

三、討論

碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少一種碳青霉烯類抗菌藥物的一類β內(nèi)酰胺酶，腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生碳青霉烯酶是其對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。在浙江瑞安地區(qū)2010年總共分離出了8株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，經(jīng)紙片擴(kuò)散法和E-test測(cè)定均對(duì)亞安培能和美羅培南耐藥。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序表明其耐藥機(jī)制均為產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶，和文獻(xiàn)［1-4］報(bào)道一致。

最近，ST-258型的產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌作為一種主要的分子流行克隆型被全球廣泛報(bào)道。本研究結(jié)果顯示在瑞安地區(qū)ST-11為產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌中主要的克隆型(5/8)，與文獻(xiàn)［4］報(bào)道的一致。ST-11與ST-258只有一個(gè)單基因位點(diǎn)變異(ton B)，這表明他們之間密切相關(guān)。ST-11和ST-258屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體CC258，這個(gè)復(fù)合體包括了 ST-11、ST-258和其他 5個(gè) ST型(ST270、ST340、ST379、ST407和 ST418)。CC258與耐萬(wàn)古霉素腸球菌(VRE)的CC17及耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)的CC22以同一種方式廣泛傳播。ST-11可能是產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌的另一種優(yōu)勢(shì)克隆型。由此可以推斷有些ST型(ST-11和ST-258)可能比較容易在質(zhì)粒存留，使這些菌株在人群中傳播。

另外，ST-15與ST-14有一個(gè)單基因位點(diǎn)變異(inf B)，可能屬于另一個(gè)克隆復(fù)合體。ST-15可能只在美國(guó)中西部地區(qū)局限型傳播［5］。在國(guó)內(nèi)，杭州一家醫(yī)院有報(bào)道過(guò)一例［4］。本研究中有一株ST-15，屬于散發(fā)流行。2011年希臘首次報(bào)道了ST-494［6］，本研究中ST-494為國(guó)內(nèi)首次報(bào)告。

在國(guó)內(nèi)，產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌以前只在少數(shù)地方報(bào)道過(guò)，現(xiàn)在已經(jīng)全國(guó)流行。瑞安地區(qū)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌也越來(lái)越多的被發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯的蔓延令人擔(dān)憂。因此，我們應(yīng)認(rèn)真關(guān)注這一問(wèn)題，密切監(jiān)測(cè)和采取嚴(yán)格的感染控制措施來(lái)控制醫(yī)院感染。

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