聚乙二醇沉淀法與凝膠色譜層析法檢測(cè)巨泌乳素的相關(guān)性研究

王 霞， 劉金玲， 高 碩

(1.天津市血液中心，天津300110;2.天津市醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052)

泌乳素(prolactin，PRL)是垂體前葉分泌的一種多肽類激素。PRL的正確檢測(cè)關(guān)系到臨床正確診斷、合理治療和預(yù)后的判斷。文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］巨泌乳素(macroprolactin，MPRL)的存在是導(dǎo)致高PRL的重要原因之一。MPRL能被某些免疫檢測(cè)儀誤認(rèn)為PRL報(bào)告給臨床，給高泌乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)的診斷帶來(lái)很大干擾。如何排除干擾，提高PRL檢測(cè)的準(zhǔn)確性已成為臨床和實(shí)驗(yàn)室關(guān)注的重點(diǎn)。

目前，凝膠色譜層析(gel filtration chromatograpy，GFC)法被公認(rèn)為檢測(cè)MPRL的金標(biāo)準(zhǔn)［3］，但因檢測(cè)技術(shù)較復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)且費(fèi)用昂貴而不適合臨床常規(guī)篩查。相比較而言，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)沉淀法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行。我們對(duì)PEG沉淀法與GFC法進(jìn)行比較，初步探討PEG沉淀法檢測(cè)MPRL的可行性。

材料和方法

一、標(biāo)本來(lái)源

選自2009年1月至2010年1月就診于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科及內(nèi)分泌科的HPRL患者26例，均為女性，年齡18～46歲。所有標(biāo)本經(jīng)Bayer ACS180化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定血清PRL后，留取血清－70℃保存待檢，同時(shí)搜集該病例的臨床診斷及影像學(xué)資料，根據(jù)臨床診斷、影像學(xué)資料及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分為真性HPRL組(簡(jiǎn)稱真泌組)11例及MPRL血癥組(簡(jiǎn)稱巨泌組)15例。

二、GFC法分離血清PRL

1.凝膠色譜柱 規(guī)格1.6 cm×80 cm凝膠色譜柱購(gòu)自天津嘉悅玻璃制品有限公司。

2.填充介質(zhì) Sephadex G100購(gòu)自美國(guó)法瑪西亞生物有限公司。

3.組分定標(biāo) 蘭葡聚糖(相對(duì)分子質(zhì)量2.5×103)，乙醇脫氫酶(相對(duì)分子質(zhì)量150×103)，牛血清白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量66×103)，碳酸酐酶(相對(duì)分子質(zhì)量29×103)，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司。根據(jù)定標(biāo)體積收集目標(biāo)組分。

4.洗脫緩沖溶液配制 10 mmol/L Tris緩沖液(pH 值 7.4)，含 10 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、1.25 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2及0.02%NaN3。使用前用0.4 μm 濾膜抽濾，4 ℃保存待用。

5.儀器 BS-100A型自動(dòng)部分收集器及自動(dòng)恒流泵均購(gòu)自上海滬西分析儀器有限公司。UV-2501型紫外分光光度檢測(cè)儀購(gòu)自日本島津公司。

6.標(biāo)本預(yù)處理 血清自－70℃取出融化后平衡至室溫，混勻后2 000×g離心10 min，取血清中段，用0.2μm濾膜過(guò)濾，吸取血清待用。

7.GFC法上機(jī)分離參數(shù) 流速0.5 mL/min，上樣量1.0 mL。洗脫相為10 mmol/L Tris緩沖液(pH 值7.4)。

8.收集組分 每收集1.5 mL為一管，每份標(biāo)本收集100管，經(jīng)Bayer ACS180化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)PRL濃度。將檢測(cè)結(jié)果錄入EXCEL表格并繪制PRL層析圖。

三、PRL及MPRL檢測(cè)

1.PRL檢測(cè) Bayer ACS180化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑均購(gòu)自美國(guó)拜耳公司，高、中、低值質(zhì)控品均購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。PRL檢測(cè)靈敏度為0.3 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為2.5%～3.8%，批間 CV為3.6%～4.5%。

2.MPRL篩查 25%PEG(相對(duì)分子質(zhì)量為6 000)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，溶液4℃保存用作 MPRL的沉淀劑。AllegraTMCentrifuge超速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

3.MPRL篩查方法 每份血清取250μL，加等量的25%PEG溶液，充分混勻后室溫放置30 min，4℃ 2 000×g離心30 min，取上清液分別檢測(cè)PRL值。PRL測(cè)定回收率=［(PEG沉淀后PRL值×2)/PEG沉淀前PRL值］×100%，回收率≤40%提示該標(biāo)本含有MPRL［4-6］。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。因數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，故采用中位數(shù)(P2.5～P97.5)表示。多組數(shù)據(jù)比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，線性回歸分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GFC法分離MPRL與真性HPRL的PRL層析譜

混合標(biāo)準(zhǔn)品分離結(jié)果見圖1。根據(jù)目標(biāo)PRL相對(duì)分子質(zhì)量大小，依據(jù)定標(biāo)體積收集相應(yīng)組分。MPRL血癥色譜分離結(jié)果見圖2，HPRL色譜分離結(jié)果見圖3。

圖1 GFC法混合標(biāo)準(zhǔn)品分離結(jié)果

圖2 GFC法分離MPRL血癥各組分PRL

圖3 GFC法分離HPRL各組分PRL

二、真泌組與巨泌組PEG處理前、后PRL濃度比較

真泌組與巨泌組血清處理前總PRL濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.113)，而處理后真泌組明顯高于巨泌組(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 真泌組和巨泌組PEG處理前、后PRL濃度比較 (ng/mL)

三、GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組與巨泌組單體PRL濃度的比較

采用GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組和巨泌組單體PRL濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

表2 GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組與巨泌組單體PRL濃度 (ng/mL)

四、GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組與巨泌組單體PRL回收率比較

GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組與巨泌組單體PRL回收率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表3。

表3 GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)真泌組與巨泌組單體PRL回收率 (%)

五、GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)26例HPRL血清單體PRL的相關(guān)性比較

PEG沉淀法與GFC法的相關(guān)性良好［相關(guān)系數(shù)(r)=0.844，P=0.000］，見圖4。

圖4 GFC法與PEG沉淀法檢測(cè)單體PRL的相關(guān)性比較

討 論

垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成的PRL含有199個(gè)氨基酸，其中包括6個(gè)半胱氨酸。經(jīng)GFC法確認(rèn)，主要存在3種不同相對(duì)分子質(zhì)量的PRL，即有活性的23×103的單體PRL、無(wú)或低生物活性而有免疫反應(yīng)性的(45～60)×103的大PRL及＞100×103的 MPRL。正常人血清中單體 PRL約占85%～95%，MPRL 僅約占1%［7］。

GFC法作為MPRL血癥經(jīng)典的確證試驗(yàn)，最大的優(yōu)點(diǎn)是能很好的區(qū)分MPRL、大PRL及單體PRL，直接證明血清中MPRL的存在，并能通過(guò)色譜洗脫曲線峰下面積計(jì)算PRL各種分子形式的比例和含量。

本研究中真性HPRL患者與MPRL患者血清總PRL濃度在PEG處理前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.113)，表明MPRL血癥與真性HPRL在生化指標(biāo)上很難區(qū)分，而PEG處理后真泌組明顯高于巨泌組(P＜0.05)，提示MPRL具有免疫反應(yīng)性，對(duì)某些檢測(cè)系統(tǒng)免疫檢測(cè)造成干擾［8］。本研究利用GFC法證實(shí)的MPRL血癥與真性HPRL患者單體PRL比例不同，真性HPRL中單體PRL占46.12%～81.73%，MPRL血癥中單體 PRL僅占7.43%～35.95%，二者比較有明顯差異(P=0.000)。

本研究表明PEG沉淀法與GFC法具有良好的相關(guān)性(r=0.844，P=0.000)，與Lucille 等［3］報(bào)道的研究結(jié)果相一致(r=0.80)，且本研究結(jié)果也表明PEG沉淀法具有良好的穩(wěn)定性。

Quinn等［9］報(bào)道在PRL增高患者中有25%存在MPRL，真性HPRL和MPRL血癥不能僅僅根據(jù)臨床表現(xiàn)區(qū)分。因此，正確診斷HPRL，避免不必要的檢查和不恰當(dāng)?shù)闹委煛㈦S訪，對(duì)PRL增高的患者進(jìn)行篩查是有必要的。盡管GFC法是檢測(cè)MPRL的金標(biāo)準(zhǔn)［10］，但由于技術(shù)復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴，限制了其在實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)使用。本研究對(duì)PEG沉淀法與GFC法進(jìn)行方法學(xué)比較，初步結(jié)果表明PEG法與GFC法具有良好的相關(guān)性，且簡(jiǎn)便、易行?？煽紤]作為實(shí)驗(yàn)室MPRL血癥的常規(guī)篩查方法。

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