高壓液相色譜檢測糖尿病患者尿白蛋白的應(yīng)用

史 梅， 史偉峰， 李燕梅

(常州市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州213003)

近年來，尿白蛋白應(yīng)用日趨廣泛［1］，正逐漸成為尿液蛋白化學(xué)的重要檢測項目。除作為傳統(tǒng)意義上的腎臟損傷的診斷及檢測指標(biāo)外，也被用于糖尿?。?］并發(fā)癥、心血管疾病危險因子的早期診斷和監(jiān)測等。尿白蛋白檢測的名稱曾一度被稱為尿微量白蛋白檢測。近來國際相關(guān)專家提議規(guī)范的名稱應(yīng)采用尿白蛋白檢測［3］。近期發(fā)現(xiàn)糖尿病(可能也包括心血管病、高血壓)患者尿中的一部分白蛋白用常規(guī)的免疫化學(xué)檢測手段不能檢出，且在尿中出現(xiàn)得比較早，這種蛋白暫且被命名為免疫化學(xué)非反應(yīng)性白蛋白(immunochemically nonreactive urinary albumin，INUA)。INUA 目前已引起極大關(guān)注。為了準(zhǔn)確檢測尿白蛋白，提早檢出異常尿白蛋白，我們改進(jìn)尿白蛋白的檢測方法，嘗試用高效液相色譜法(HPLC)檢測尿總白蛋白，將其與臨床常規(guī)免疫方法進(jìn)行比較，并初步應(yīng)用于臨床樣本的檢測。

材料和方法

一、對象

選擇常州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科患者糖尿病(DM)患者85例，男40例，女45例，年齡20～88歲，收集24h尿液。正常對照組40名，男19名，女21名，年齡21～82歲，為常州市第一人民醫(yī)院健康體檢人群，排除DM、腎臟疾病、高血壓、心血管、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病，年齡、性別組成與DM組匹配。樣本收集后凍存于－70℃待檢。

二、方法

每例樣本分別采用HPLC和免疫比濁法測定尿白蛋白。

HPLC參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行檢測。Agilent 1200色譜儀，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm、5μm column色譜柱，流動相為乙腈∶H2O=93∶7，0.1%TFA，柱溫40 ℃，檢測波長210 nm，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司，產(chǎn)品號p0914)。

免疫比濁法(免疫散射比濁法)采用BECKMAN-COULTER IMMAGE 800免疫比濁儀及配套試劑(貝克曼庫爾特公司)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以±s表示，偏態(tài)分布的資料以中位數(shù)(范圍)表示。非正態(tài)分布的2組之間比較采用Mann-Whitney U檢驗。2種方法間結(jié)果的比較用直線回歸和Bland-Altman進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HPLC檢測結(jié)果

白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品含量分別為500、200、100、50及0 mg/L。以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，與含量相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)作圖，兩者呈良好線性關(guān)系，用最小二乘法得出回歸方程為Y=2.948 2X+38.601，r2=0.994 4。見圖1。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的保留時間(RT)均為2.42 min。見圖2。

尿白蛋白濃度為40.1和152.6 mg/L的樣本其批內(nèi)和批間CV分別為4.1%、4.8%和5.6%、6.5%。最低檢測限為2 mg/L。

圖1 HPLC測定白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的線性

圖2 HPLC測定尿白蛋白的色譜圖

二、HPLC和免疫比濁法測定尿蛋白的結(jié)果比較

85例糖尿病患者的尿液樣本用HPLC和免疫比濁法測定的白蛋白濃度分別為21.0(3.4～678.9)mg/L和 8.2(2.0～442.2)mg/L，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);HPLC測出的結(jié)果普遍偏高，但偏高的倍數(shù)不一致，最小為1.3倍，最大為6.1倍。正常對照組HPLC法和免疫比濁法測定的白蛋白濃度分別為6.8(2.8～12.4)mg/L和 5.2(2.0～10.1)mg/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

將2種方法的測定結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以免疫比濁法測定結(jié)果為X，HPLC測定結(jié)果為Y，回歸分析結(jié)果見圖3，方程為Y=17.58+1.703X，r2=0.79。2種方法的相關(guān)性和一致性較差。

將2種方法進(jìn)行Bland-Altman一致性分析，以2種方法測定值的均值為橫坐標(biāo)，HPLC與免疫比濁法的差值為縱坐標(biāo)，散點圖見圖4。有4個點(4.7%，4/85)落在偏倚均值±2s范圍外，界限內(nèi)的最大差值(184.7 mg/L)相對于2種方法的均值(51.7 mg/L)來說偏倚已相當(dāng)大，臨床上不能接受，2種方法一致性較差。

以尿白蛋白排泄率(AER)＞30 mg/24h為診斷微量蛋白尿的標(biāo)準(zhǔn)，HPLC和免疫比濁法檢出的陽性例數(shù)分別為48例(56.5%)和27例(31.8%)。有21例(24.7%)DM 患者的尿樣本用HPLC檢測出微量蛋白尿，而常規(guī)免疫比濁法未測出。

圖3 免疫比濁法和HPLC尿白蛋白測定結(jié)果的直線回歸分析

圖4 HPLC和免疫比濁法結(jié)果進(jìn)行Bland-Altman分析

討 論

尿白蛋白檢測項目臨床應(yīng)用極為廣泛，對多種疾病引起的腎臟損傷具有重要預(yù)測價值。尿白蛋白的定量方法從化學(xué)法進(jìn)步到免疫法，以至HPLC、質(zhì)譜法以及尿液蛋白質(zhì)組學(xué)等，但仍存在很多問題而影響測定的準(zhǔn)確性以及測定結(jié)果的一致性和互通性。我國目前尚無統(tǒng)一的指南規(guī)范尿白蛋白的檢測及報告要求，尿白蛋白檢測及報告中存在著諸多問題，影響其更好的臨床應(yīng)用。2001年Greive等［5］發(fā)現(xiàn)患DM鼠的尿中白蛋白含量增高，但用常規(guī)的免疫化學(xué)法無法檢測到。Comper等［6］用HPLC來測定糖尿病患者尿中的白蛋白，證實了尿中存在著用免疫化學(xué)法不能測定的白蛋白，目前暫時被命名為INUA。

本研究結(jié)果顯示DM患者尿白蛋白的HPLC檢測結(jié)果普遍高于免疫比濁法，但偏高的倍數(shù)不一致，最小為1.3倍，最大為6.1倍，并不是相同的系統(tǒng)偏差。將2種方法用回歸和Bland-Altman進(jìn)行一致性分析，也證明2種方法的一致性較差。正常對照組HPLC和免疫比濁法的測定值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。本研究所用的Sigma公司白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和免疫散射比濁法尿微量白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品可溯源至同一白蛋白國際參考物;這個結(jié)果類似于Comper等［6］的實驗結(jié)果，說明2種方法結(jié)果的差異并非兩者標(biāo)準(zhǔn)品不同所致，而是由于不同患者尿液中INUA和免疫化學(xué)反應(yīng)性白蛋白兩者的比例不同。HPLC和免疫比濁法檢測中達(dá)到診斷微量蛋白尿的例數(shù)分別為48例和27例，檢出率分別為56.5%和31.8%，HPLC的陽性檢測率明顯高于免疫比濁法，其中21例用HPLC檢測已經(jīng)達(dá)到微量蛋白尿診斷標(biāo)準(zhǔn)，而用免疫比濁法檢測為陰性。這是因為免疫比濁法的原理是抗原抗體反應(yīng)，常用的免疫化學(xué)原理的分析方法只能檢測出那些具有免疫原性的完整白蛋白及一些相對分子質(zhì)量＞12 000的白蛋白片段和多聚白蛋白凝聚物。而尿液中的白蛋白性質(zhì)極為復(fù)雜，在其經(jīng)腎臟濾過時，受溶酶體酶的化學(xué)修飾作用，可產(chǎn)生＜1%的完整白蛋白及＞99%的白蛋白源性片段(相對分子質(zhì)量＜10 000)。INUA是白蛋白經(jīng)過腎小管細(xì)胞溶酶體酶處理后的改變形式，雖然其分子仍由17個二硫鍵連成一體，是完整的白蛋白分子，但已受到了損傷，其分子構(gòu)型發(fā)生了改變，免疫檢測方法的抗體不能與之結(jié)合，因而不能被檢出。由于其相對分子質(zhì)量仍為66 500，并沒有發(fā)生改變，因此HPLC同樣能檢出。DM的早期腎損傷主要是腎溶酶體降解白蛋白和其他蛋白的功能減低。隨著腎小球損傷的加重而濾膜的孔徑加大，濾過更多的蛋白，溶酶體降級功能不良更加明顯，導(dǎo)致更多完整但受損的白蛋白分子出現(xiàn)在尿中，其分子構(gòu)型有了改變。還有研究認(rèn)為DM患者血中經(jīng)常升高的葡萄糖和脂肪酸也會引起白蛋白構(gòu)型的改變。因此，DM及一些腎臟病早期的白蛋白尿采用目前的免疫檢測方法難以得到準(zhǔn)確反映，也存在著較高的漏診率。

HPLC具有檢測靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確性好的優(yōu)點，雖然與臨床常用的免疫學(xué)方法相比操作比較復(fù)雜，但HPLC能檢出包括免疫化學(xué)反應(yīng)性和免疫化學(xué)非反應(yīng)性的總的白蛋白，能更準(zhǔn)確地反映尿液中的白蛋白含量，可以提高糖尿病腎病(DN)患者中微量白蛋白的檢出率，以利于DN的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。有資料表明，HPLC法檢測尿白蛋白可以提前預(yù)測DM發(fā)生血管病變的風(fēng)險［7］。在目前尚無簡便可行的方法能測出尿總白蛋白的情況下，HPLC檢測尿白蛋白具有一定的臨床意義，但還需要大規(guī)模的臨床研究。

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