糖尿病大鼠胃腸排空與心房利鈉多肽的相關性

劉世雄 劉世寶 趙 麗 嚴 祥 王 晶 (蘭州大學第一醫(yī)院老年科，甘肅 蘭州 730000)

糖尿病患者往往伴有胃腸動力障礙，多表現(xiàn)為胃腸排空延遲、蠕動減慢，但其病理機制至今尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)心房利鈉多肽(ANP)廣泛存在于胃腸道并參與調(diào)節(jié)胃腸道的吸收、分泌和運動〔1，2〕。血糖升高后ANP的分泌也會增加，然而糖尿病胃腸動力障礙是否與ANP的變化有關目前尚不清楚。本文探討ANP在血漿和胃竇平滑肌的變化并分析其與胃腸排空延遲的關系。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分組 8周齡SPF級雄性Wistar大鼠40只(購自蘭州大學動物實驗中心)，體重約180 g，隨機分為對照組、單純肥胖組和糖尿病組。對照組喂以常規(guī)飼料，飲用自來水，單純肥胖組、糖尿病組大鼠喂以高糖高脂飼料(豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鈉1%，常規(guī)飼料66.5%)，飲用120 g/L果糖水。喂養(yǎng)8 w測定體質量、血糖后，禁食不禁水12 h，糖尿病組腹腔一次性注射30 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，對照組、單純肥胖組腹腔注入同等體積的枸櫞酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)4 w，糖尿病組大鼠以空腹血糖大于16.7 mmol/L為造模成功。成模后對照組、單純肥胖組大鼠分別為8、11只，糖尿病組為13只。

1.2 胃腸排空的測定 12 w后大鼠禁食不禁水24 h，再次稱體重、測血糖后用濃度為0.5 mg/ml的5%葡萄糖酚紅溶液1.5 ml灌胃，灌胃后30 min后處死大鼠，打開腹腔，快速結扎賁門、幽門和回盲部，分離胃、小腸，并將小腸拉直后分為近(40%)、中(30%)、遠(30%)三部分。分別剖開胃、小腸各段，以蒸餾水沖洗內(nèi)容物，定容為20 ml，而后加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 ml攪拌混勻，靜置后取5 ml上清液加入三氯乙酸去蛋白，3 500 r/min 4℃離心10 min。取上清液用分光光度計在560 nm波長下測定吸光度值。另取酚紅溶液先后加入蒸餾水、氫氧化鈉、三氯乙酸攪拌混勻，測定吸光度值為標準酚紅吸光度值。按下式計算各段酚紅殘留率:酚紅殘留率(%)=(各段酚紅殘留量/胃腸內(nèi)酚紅總殘留量)×100%。

1.3 放免法測定血漿ANP濃度 在0、8、12 w分次采血，取血漿放入－70℃冰箱保存?zhèn)錂z。試劑盒由解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術研究所提供。

1.4 胃竇肌層ANP陽性細胞光密度的測定 取大鼠胃竇-幽門處胃組織固定、包埋后切片、染色，計算機輔助圖像分析觀察胃竇平滑肌層中陽性細胞的染色及分布情況并得到陽性表達光密度，取同期大鼠心臟切片設立陽性對照。

2 結果

2.1 一般情況 8 w后單純肥胖組和糖尿病組大鼠體質量較對照組顯著增加(P＜0.05)，糖尿病組和單純肥胖組之間差異無顯著性(P＞0.05)。單純肥胖組和糖尿病組血糖有所增高，但與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。注射STZ或枸櫞酸緩沖液4 w后，糖尿病組大鼠血糖水平升高達到糖尿病診斷標準，與對照組及單純肥胖組比較差異有顯著意義(P＜0.05)。單純肥胖組與對照組比較血糖水平差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.2 胃腸排空的變化 見圖1，灌胃后30 min糖尿病組大鼠胃和近段小腸內(nèi)酚紅殘留率均多于對照組和單純肥胖癥(P＜0.05)，而中段和遠段小腸酚紅殘留率均少于對照組和單純肥胖癥(P＜0.05);對照組和單純肥胖癥胃和小腸各段酚紅殘留率兩組比較無意義(P﹥0.05)。

2.3 血漿ANP的變化 見表1，與對照組和單純肥胖組相比，8 w后糖尿病組血漿ANP的濃度無變化，但12 w后ANP的濃度較對照組和單純肥胖組顯著升高(P＜0.05)。而對照組和單純肥胖組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表1 0、8、12 w各組大鼠體質量、血糖及血漿ANP、胃竇肌層ANP陽性細胞光密度值比較(s)

表1 0、8、12 w各組大鼠體質量、血糖及血漿ANP、胃竇肌層ANP陽性細胞光密度值比較(s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與單純肥胖組比較:2)P＜0.05

1.4 83.2±9.8 4.203±0.137單純肥胖組11174.46±10.71 359.86±22.76 459.28±29.03 5.70±1.42 7.05±0.92 7.98±0.77 81.3±11.5 86.2±9.6 84.7±10.1 4.981±0.075糖尿病組 13 175.46±9.97 361.75±22.03 461.92±22.851)5.49±0.86 7.86±1.91 21.37±2.421)2)78.4±9.2 82.2±7.4 124.1±11.91)2)8.227±1.0641)2)對照組 8 178.27±11.34 253.27±10.97 382.94±13.70 5.14±1.03 6.01±1.41 5.45±0.92 79.2±9.3 83.9±1

圖1 胃腸排空的變化

2.4 胃竇平滑肌層ANP陽性細胞圖像分析光密度值比較見表1，在各組大鼠胃竇平滑肌層中均觀察到了ANP陽性細胞，以肌間神經(jīng)叢中最為廣泛。在糖尿病組肌間神經(jīng)叢中ANP免疫反應陽性細胞較對照組、單純肥胖組均明顯增高(P＜0.05)，光鏡下見神經(jīng)元胞體及神經(jīng)纖維普遍著色，呈棕黃色顆粒狀，胞漿著色，呈陽性或強陽性反應。而對照組、單純肥胖組ANP神經(jīng)網(wǎng)絡稀疏，神經(jīng)節(jié)密度較低，陽性細胞數(shù)較少，染色較淡呈弱陽性反應。陰性對照片在大鼠的胃神經(jīng)叢內(nèi)無棕黃色染色。

2.5 血漿ANP濃度、胃竇平滑肌層ANP陽性細胞光密度值與血糖、胃腸各段酚紅殘留率的相關性分析 通過相關性分析發(fā)現(xiàn)12 w后糖尿病組大鼠血漿ANP濃度與近段小腸內(nèi)酚紅殘留率呈正相關(r=0.632，P=0.021)，而與胃、中段和遠段小腸酚紅殘留無相關性(r=0.076，P=0.103);胃竇平滑肌層ANP陽性細胞光密度值與胃內(nèi)酚紅殘留率呈正相關(r=0.591，P=0.035)，而與小腸各段酚紅殘留無相關性(r=0.168，P=0.197)。

3 討論

ANP具有強大的利鈉、利尿和拮抗腎素-醛固酮系統(tǒng)等作用，主要存在于哺乳動物的心房肌細胞的細胞質中。在中樞水平ANP主要是通過參與副交感神經(jīng)來完成對胃腸功能的調(diào)節(jié)。除了受中樞神經(jīng)系統(tǒng)的支配外，還發(fā)現(xiàn)豚鼠的胃和小腸能合ANP并通過旁分泌和自分泌形式作用于胃腸道抑制胃腸運動，這種抑制效應是通過提高細胞內(nèi)cGMP水平而實現(xiàn)的〔3〕。通過前期的研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大鼠胃排空延遲與血漿ANP濃度升高有關〔4〕，同胃動素、血管活性腸肽(VIP)、生長抑素(SS)、P物質(SP)、一氧化氮(NO)等一樣，ANP也是胃腸激素的成員之一，且是一種抑制性遞質。

糖尿病患者往往合并胃腸道運動功能障礙，發(fā)生機制與多種因素有關，其中胃腸激素失調(diào)是主要原因之一。已經(jīng)有許多研究表明糖尿病患者存在胃動素、VIP、SS、SP、NO等多種胃腸激素分泌的失調(diào)〔5～7〕。

研究顯示1型、2型糖尿病患者和大鼠的血漿ANP濃度均明顯升高〔8～10〕，本研究結果也證明了2型糖尿病大鼠血漿ANP濃度較對照組和單純肥胖組均升高。然而對血漿ANP濃度升高的原因尚有不同看法。Allen等〔11〕認為血漿ANP的升高可能與血糖升高后導致的血容量增加有關。但ANP濃度的增加是否與血糖有直接關系尚不得而知，通過分析后我們未發(fā)現(xiàn)血漿ANP濃度與血糖存在一定的相關性。

在胃黏膜中當ANP與相應受體結合后使細胞內(nèi)的cGMP水平增加。通過cGMP途徑，刺激SS分泌，進而抑制胃竇部胃泌素和胃底部組織胺的分泌〔1，2〕，而SS、胃泌素的變化均可抑制胃排空。Guo等〔12〕利用放射自顯影技術證實ANP受體還廣泛存在于大鼠胃平滑肌層中，其中以胃竇部密度為最大。他們還進一步證實了ANP可明顯抑制大鼠胃竇環(huán)行肌條的收縮。

本研究結果說明糖尿病大鼠存在液體胃排空延遲和腸通過時間延長，血漿ANP濃度及胃竇平滑肌ANP的表達增加可能是導致糖尿病大鼠胃腸道排空延遲的原因之一。

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