耳針血清對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞擬糖尿病損傷的保護(hù)作用

梅志剛 劉曉潔 曾永保 肖長(zhǎng)義 黎家華 胡 衛(wèi) 陳良金

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002)

糖尿病患者體內(nèi)高脂、高糖、高胰島素血癥及其他精神因素慢性刺激而引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、非酶性糖基化終末產(chǎn)物的形成、蛋白激酶C信號(hào)通路和多元醇通路激活以及己糖胺通路活性升高等〔1〕，臨床研究發(fā)現(xiàn)，電針耳甲區(qū)迷走神經(jīng)分布區(qū)穴位具有即時(shí)降低血糖，改善糖耐量等作用〔2，3〕;本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)耳針具有抗炎，減低胰島素抵抗等作用〔4〕。本研究試圖揭示耳針?lè)乐翁悄虿⊙懿l(fā)癥的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠80只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2010-0007〕，體重200～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)數(shù)字表法挑選10只作為正常組大鼠(組1)，以普通飼料喂養(yǎng)。其余70只采用高脂、高糖飼料(蛋白質(zhì)23%，碳水化合物53%，脂肪5%，纖維19%)飼養(yǎng)8 w后禁食12 h，按35 mg/kg劑量1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)，參照Srinivasan等方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ 1 w后尾靜脈取血約0.05 ml以O(shè)netouch血糖儀(強(qiáng)生公司)測(cè)定空腹血糖(FBG)，并以FBG≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型。將造模成功的49只大鼠(另外21只大鼠因造模失敗或死亡而排除)隨機(jī)分為:模型組(組2，共6只)、耳針組(組3，共8只)、迷走神經(jīng)切斷組(組4，共7只)、阿托品組(組 5，共8只)、六烴季銨組(組 6，共 7只)和α-銀環(huán)蛇毒素組(組7，共7只)。各組分別作如下處理:組2動(dòng)物未作處理，為模型對(duì)照;組3:電針刺激大鼠耳胰膽及神門(mén)穴，每次30 min(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果刺激強(qiáng)度為2 mA，頻率10 Hz，脈寬0.4 ms)。組4～7均在給予組3同樣的耳穴電針刺激之前作如下處理:組4動(dòng)物切斷耳針刺激側(cè)頸部迷走神經(jīng);組5、組6和組7分別給予尾靜脈注射阿托品(0.1 mg/kg)、六烴季銨(10 mg/kg)和α-銀環(huán)蛇毒素(1.0 μg/kg)，上述各組處理1次/d，共計(jì)10 d。最后一次處理結(jié)束，立即以20%烏拉坦200 g/ml麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，離心收集大鼠血清，以0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(BMEC)購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司(批號(hào):11875-093)，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)。正常細(xì)胞培養(yǎng)液每100 ml各成分含量為:1640培養(yǎng)液87 ml、胎牛血清10 ml、丙酮酸鈉 1 ml、HEPES液 1 ml、1 U 的雙抗1 ml。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，以0.125%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸鈉(EDTA)消化，傳代，鏡下調(diào)整細(xì)胞密度為8×103/cm2，傳代后每3 d換液1次，傳代細(xì)胞4～6 d可形成鋪路石樣緊密分布，傳至第4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 糖尿病血管并發(fā)癥細(xì)胞模型制作及分組處理 將上述正常培養(yǎng)細(xì)胞分為7組(每組12孔):正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、針刺組、迷走神經(jīng)切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組。正常對(duì)照組以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余6組根據(jù)筆者以往研究結(jié)果〔5〕，分別加入糖尿病血管并發(fā)癥內(nèi)皮細(xì)胞模型造模條件培養(yǎng)液:含有 20 mmol/L葡萄糖、100 mU/L胰島素和200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)基(下簡(jiǎn)稱(chēng)造模液)，同時(shí)分別加入上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物收集的組2～7的耳針血清，并配置成10%的終濃度，即A正常組條件培養(yǎng)液為:1640培養(yǎng)基;B模型組:造模液+10%組2大鼠血清;C針刺組:造模液+10%組3大鼠血清;D迷走神經(jīng)切斷組:造模液+10%組4大鼠血清;E阿托品組:造模液+10%組5大鼠血清;F六烴季胺組:造模液+10%組6大鼠血清;G α-銀環(huán)蛇毒素組:造模液 +10%組7大鼠血清。各組細(xì)胞加入上述條件培養(yǎng)液后于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察各組細(xì)胞活性及形態(tài)學(xué)變化。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 MTS/PMS比色分析法測(cè)定各組細(xì)胞的活性 將正常培養(yǎng)的細(xì)胞消化后離心重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為(3～5)×104/ml后接種于96孔板中，為防止孔板導(dǎo)致的邊緣效應(yīng)，共接種細(xì)胞48孔，每孔100 μl，將接種的細(xì)胞分為7組:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、耳針組、迷走神經(jīng)切斷組、阿托品組、六烴季銨組、α-銀環(huán)蛇毒素組，每組6孔。接種后24 h待細(xì)胞貼壁正常生長(zhǎng)后，小心吸走培養(yǎng)基，各組分別加入1.2中所述的條件培養(yǎng)液100 μl，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加50 μl 1×MTT溶液，37℃孵育4 h→吸出上清液→每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)→平板搖床搖勻→酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度值(OD值)。

1.4.2 流式細(xì)胞儀觀察內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況 細(xì)胞凋亡檢測(cè)按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行:將細(xì)胞條件培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌細(xì)胞1次，以胰酶(不含有EDTA)將各組細(xì)胞消化下來(lái)，加入上述收集的細(xì)胞條件培養(yǎng)液，稍混勻，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。取1.5×105個(gè)/ml重懸的細(xì)胞，離心 5 min，棄上清，加入 500 μl結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞后，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μl碘化丙啶，室溫(20℃ ～25℃)避光孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.4.3 透射電鏡觀察各組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 以0.25%胰酶-0.02%EDTA聯(lián)合消化液將各組細(xì)胞消化下來(lái)，離心后PBS洗滌3次，去除殘留的EDTA，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，輕輕反復(fù)吹打均勻，800 r/min離心5 min后，以2.5%戊二醛前固定約2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次(10 min/次)，1%鋨酸后固定1 h，0.1 mol/L PBS漂洗 3次(10 min/次)，丙酮逐級(jí)脫水(50%、70%、90%、100%)，丙酮與EPON812環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑1∶1比例浸泡→純包埋劑浸泡→包埋→修塊機(jī)修塊定位→超薄切片機(jī)切片→醋酸鈾與硝酸鉛雙重染色，最后日立H-7500透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性MTS/PMS比色分析法測(cè)定結(jié)果 正常組細(xì)胞活性正常，良好生長(zhǎng)(0.608±0.045);與正常組相比較，模型組細(xì)胞活性明顯下降(0.324±0.051，P＜0.01);給予阿托品組、耳針組含藥血清后，細(xì)胞活性較模型組細(xì)胞活性有明顯改善(0.506±0.037，0.515±0.029，P＜0.01);但迷走神經(jīng)切斷組、六烴季銨組以及α-銀環(huán)蛇毒素組大鼠血清后，其細(xì)胞活性仍明顯低于正常組和耳針組(0.330±0.047、0.362±0.130、0.355±0.038，均P＜0.01)，且與模型組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡或壞死情況 正常組細(xì)胞良好生長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率較低，主要分布于左下象限;模型組細(xì)胞凋亡較多，分布于右上象限(Q2)和右下象限(Q4)細(xì)胞比例較正常組明顯升高，差異顯著(P＜0.01);而耳針組，阿托品組細(xì)胞凋亡率較模型組細(xì)胞顯著減少(均P＜0.01);給予迷走神經(jīng)切斷組、六烴季銨組和α-銀環(huán)蛇毒素組動(dòng)物血清后，細(xì)胞凋亡率仍顯著高于正常組和耳針組(均P＜0.05)，但與模型組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率(%，s)

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率(%，s)

與正常組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與耳針組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01

10 9.28±0.84 5.30±0.65 85.33±1.33模型組 6 31.80±1.772) 37.88±3.372) 30.15±4.682)耳針組 8 22.33±1.662)4)29.90±3.022)4)47.63±4.282)4)阿托品組 8 22.55±1.032)4)32.13±4.132)4)47.08±3.682)4)迷走神經(jīng)切斷組 7 31.63±1.312)6)35.63±1.762)4)6)32.53±3.212)6)六烴季銨組 7 30.28±1.822)6)34.13±3.242)6)33.25±5.282)6)α-銀環(huán)蛇毒素組 8 30.30±0.832)6)34.78±2.282)6)32.88±1.462)6)早期凋亡率 晚期凋亡率 存活率正常組組別 n

2.3 透射電鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 正常組(A)內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰可見(jiàn);模型組(B)接受造模條件培養(yǎng)液孵化培養(yǎng)后，損傷明顯，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志凋亡小體;給予耳針組(C)或阿托品組(D)血清后，內(nèi)皮細(xì)胞受高脂高糖損傷明顯減小，耳針組可見(jiàn)到清晰的細(xì)胞微絨毛，說(shuō)明細(xì)胞新陳代謝較為旺盛，生存狀態(tài)較模型組有明顯改善;而阿托品組細(xì)胞僅見(jiàn)到染色質(zhì)加深而未見(jiàn)凋亡小體，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)也較模型組良好;給予迷走神經(jīng)切斷組(E)血清后，細(xì)胞受損情況較模型組沒(méi)有明顯改善，細(xì)胞膜碎裂，核內(nèi)物質(zhì)向細(xì)胞外散失，已具凋亡細(xì)胞的特征;而給予六烴季銨組(F)血清后，細(xì)胞凋亡情況也較為明顯，細(xì)胞核已碎裂為2部分，凋亡小體也可清晰可見(jiàn)，其細(xì)胞狀態(tài)較模型組沒(méi)有明顯改善;α-銀環(huán)蛇毒素組(G)細(xì)胞狀態(tài)也較差，與模型組細(xì)胞類(lèi)似，可見(jiàn)到明顯的凋亡小體。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為耳與經(jīng)絡(luò)以及臟腑功能有著密切的聯(lián)系，《靈樞·邪氣臟腑病形篇》云:“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其氣血皆上于面而走空竅，其精陽(yáng)氣上走于目而為睛，其別氣走于耳而為聽(tīng)?！蓖砬遽t(yī)家張振鋆與其族弟張地山著有《厘正按摩要術(shù)》-書(shū)中則提出了耳背分屬五臟的理論，指出“耳珠屬腎，耳輪屬脾，耳上輪屬心，耳皮肉屬肺，耳背玉樓屬肝”等耳與五臟分屬的生理聯(lián)系。因此，正如《衛(wèi)生寶鑒》指出的那樣:“五臟六腑，十二經(jīng)脈皆有絡(luò)于耳者。”

本課題組以往研究顯示，耳甲腔穴位胰膽電針刺激能影響孤束核葡萄糖敏感神經(jīng)元以及胰島素敏感神經(jīng)元的自發(fā)性放電頻率〔6〕;進(jìn)一步采用逆行神經(jīng)示蹤法研究發(fā)現(xiàn)，耳甲腔迷走神經(jīng)耳支末梢與孤束核以及迷走神經(jīng)背核具有投射關(guān)聯(lián)〔7〕，據(jù)此推測(cè)耳針作用機(jī)制可能與興奮迷走神經(jīng)有關(guān)。Tracy等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)刺激或采用膽堿能激動(dòng)劑可促使神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿并作用于炎性細(xì)胞表面的乙酰膽堿的N型受體α7亞單位(α7nAChR)，抑制炎癥因子，如 IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α等及趨化因子合成和釋放，從而降低或阻止局部或全身的炎癥反應(yīng)，這一機(jī)制被命名為“膽堿能抗炎通路”。前期研究顯示，電針耳甲區(qū)穴位(有迷走神經(jīng)耳支分布)可降低2型糖尿病模型大鼠循環(huán)血液中促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α以及C-反應(yīng)蛋白(CRP)的水平，并改善胰島素抵抗指數(shù)，據(jù)此推測(cè)耳針刺激可能具有與迷走神經(jīng)刺激相類(lèi)似的膽堿能抗炎效應(yīng)〔4〕。

本研究結(jié)果提示耳針血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膽堿能M受體阻斷劑阿托品對(duì)耳針保護(hù)作用無(wú)影響，而N型AchR阻斷劑六烴季銨組和N型AchR α7亞單位拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素則則能夠阻斷耳針血清的保護(hù)效應(yīng)。據(jù)此推測(cè)耳針效應(yīng)可能是通過(guò)興奮迷走神經(jīng)，并促進(jìn)乙酰膽堿的釋放及與其AchR α7亞單位結(jié)合而介導(dǎo)的。這一結(jié)果與李建國(guó)等〔9〕針刺足三里激活膽堿能抗炎通路抗大鼠失血性休克的研究結(jié)果類(lèi)似。

本文所采用的“針刺血清”的方法是受“血清藥理學(xué)”和“中藥血清學(xué)”的啟發(fā)而提出的，該方法與以往在體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)針灸后的人或動(dòng)物血清成分含量及其變化相比，可排除體內(nèi)多因素的影響，獲得了較為理想的結(jié)果，克服了在體實(shí)驗(yàn)的局限性〔10〕。然而，對(duì)于針刺血清來(lái)源、血清有效部位及其作用對(duì)象和作用途徑等，學(xué)界尚未達(dá)成一致的共識(shí)，因此關(guān)于針刺血清實(shí)驗(yàn)方法尚待進(jìn)一步規(guī)范與改進(jìn)。

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