巴馬地區(qū)壯族人群口腔黏膜細(xì)胞端粒的長度

羅曉秋 吳華裕 劉承武 彭均華 羅 桓 尹瑞興 呂澤平 潘尚領(lǐng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的“帽狀”非編碼結(jié)構(gòu)，由不同拷貝數(shù)的DNA重復(fù)序列和一些特殊的核蛋白組成。不同物種端粒長度(TL)差異較大，一般從50 bp到50 kb。即使是同一物種，不同個(gè)體之間或同一個(gè)體的不同組織之間，其端粒長短亦不相同。人類體細(xì)胞的端粒重復(fù)序列是(TTAGGG)n，其長度約5～15 kb，其中，人精子端粒長約15 kb，外周血白細(xì)胞端粒長約10 kb〔1〕。端粒的主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。然而，隨著細(xì)胞分裂、傳代次數(shù)的增加，TL的縮短不可避免地超過某個(gè)域值，最終失去對染色體的保護(hù)作用而引發(fā)細(xì)胞衰老、凋亡或細(xì)胞的永生化及腫瘤發(fā)生〔1〕。TL也作為一個(gè)可量化的性狀，被認(rèn)為是細(xì)胞復(fù)制性衰老的計(jì)時(shí)器〔2〕，并逐漸被當(dāng)作一些疾病或表型的生物學(xué)標(biāo)記〔3，4〕。本研究通過應(yīng)用熒光定量PCR的方法對世界第五長壽之鄉(xiāng)——廣西巴馬地區(qū)的壯族長壽老人、其第一代子女及該地區(qū)與長壽老人無血緣關(guān)系且年齡、性別與第一代子女相匹配的健康壯族普通人進(jìn)行口腔黏膜脫落上皮細(xì)胞的相對端粒長度(RTL)的測定，探討TL隨年齡變化的規(guī)律、遺傳趨勢及其與長壽的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 長壽組367名，男106名，女261名，年齡90～104(93.23±2.96)歲。另設(shè)兩個(gè)對照組：子女組：長壽老人的第一代子女445名，男319名，女126名，年齡39～76(58.12±7.08)歲;對照組：與子女組年齡、性別相匹配且與長壽老人無血緣關(guān)系的本地普通壯族人群175名，男128名，女47名，年齡38～79(58.77±10.14)歲，見表1。長壽老人為調(diào)查時(shí)居住在廣西巴馬地區(qū)(東蘭、巴馬、鳳山及都安四縣)年齡≥90歲的老人，對照組為家中三代內(nèi)無≥90歲老人且與長壽老人無任何血緣關(guān)系的普通人群。所有研究對象均為壯族，生活習(xí)慣及勞動(dòng)條件基本相同。所有受檢者在采樣之前接受問診、認(rèn)知、自理能力測試，排除心、腦血管病、糖尿病、老年癡呆癥等老年相關(guān)性疾病，基本上屬于健康受試對象。

表1 三組不同年齡段組成(n)

1.2 標(biāo)本的采集與處理 每個(gè)受試對象在采樣前常規(guī)漱口，繼之漱以生理鹽水，然后用棉拭子刮取口腔左側(cè)頰部黏膜30次，用裝有1 ml生理鹽水的離心管存放刮取物，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提取 將凍存的口腔脫落上皮細(xì)胞用蛋白酶K進(jìn)行消化，過夜后用經(jīng)典苯/氯仿法提取DNA，-20℃保存。

1.3.2 端粒長度測定 參照文獻(xiàn)〔5〕，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行口腔脫落上皮細(xì)胞相對端粒長度的測定，主要步驟如下：①引物序列：由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。端粒的引物：上游：5'ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT 3'，下游：5'TGTTAGGTATCCCTATCCCT ATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3';內(nèi)參36B4基因的引物：上游：5'CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3'，下游：5'CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3';②端粒與內(nèi)參36B4基因Ct值的測定：端粒與內(nèi)參36B4基因的擴(kuò)增在不同的96孔板中進(jìn)行，每個(gè)96孔板均含一個(gè)相同的參照樣品。反應(yīng)體系均為20 μl，其中Mix(Roche產(chǎn)品)均為10 μl，DNA模板均為50 ng，端粒上下游引物終濃度均為0.8 μmol/L，36B4基因上下游引物終濃度均為0.4 μmol/L，其余體積用雙蒸水補(bǔ)足。端粒的反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，49℃ 1 min，進(jìn)行 2 個(gè)循環(huán)，然后，95℃ 15 s，62℃ 1 min，72℃ 20 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)并在 72℃收集熒光。36B4基因的反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)，60℃收集熒光，反應(yīng)結(jié)束繪制熔解曲線。

1.3.3 T/S比率的計(jì)算 采用real-time PCR儀配套軟件，分別確定端粒反應(yīng)及內(nèi)參36B4基因反應(yīng)的 Ct值-Ct及 Ct(36B4)，根據(jù)PCR反應(yīng)產(chǎn)物以2的指數(shù)倍遞增原理，T/S比率接近于公式〔2Ct(telomeres)/2Ct(36B4)〕-1=2-△Ct。為消取每個(gè)96孔板間的誤差而選用參照樣品作為陽性對照，RTL即為相對T/S值=2-△Ct(待測樣品)/2-△Ct(參照樣品)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析，各組之間RTL的中位數(shù)差異用兩個(gè)獨(dú)立樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn);RTL與年齡的關(guān)系用Spearson相關(guān)、偏相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 TL的遺傳 將對照組與長壽組組合成年齡從38～104歲且個(gè)體間無血緣關(guān)系的普通群體，其RTL與年齡的相關(guān)系數(shù)為(R=-0.102，P=0.018);將子女組與長壽組組合成年齡從39～104歲有血緣關(guān)系的長壽群體，其RTL與年齡的相關(guān)系數(shù)為(R=-0.026，P=0.461)，表明TL的維持在長壽群體中更優(yōu)越。子女組與對照組在較低年齡段(＜65歲年齡段)RTL雖無顯著差異，但子女組中較高年齡段(65歲～年齡段)的RTL明顯長于同年齡段的對照組(P=0.026)，同時(shí)，長壽組(90歲～年齡段)的RTL與對照組高年齡段(65～年齡段)的RTL相當(dāng)(1.662～1.709，P=0.755)，提示長壽群體中特別到了65歲以后端粒的縮短速率明顯減慢。見表2。

表2 長壽組、子女組、對照組不同年齡段的RTL〔中位值(范圍)〕

2.2 TL與年齡 以年齡為橫坐標(biāo)，口腔上皮脫落細(xì)胞 RTL為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖。因不同組別及性別間端粒長度存在差異，所以以組別和性別為控制變量，應(yīng)用偏相關(guān)分析。總體的RTL與年齡的相關(guān)系數(shù)為(R=-0.109，P=0.001);控制組別后，總體男性的RTL與年齡的相關(guān)系數(shù)為(R=-0.121，P=0.005)，女性為(R=-0.091，P=0.059)。這些結(jié)果表明，在研究人群中，口腔黏膜細(xì)胞RTL隨著年齡的增大而縮短，這種變化在男性中也存在但在女性中沒有顯示出來。

2.3 TL與性別 總體人群、組合人群及不同組別各年齡段男、女之間的RTL比較見表3。在長壽組與子女組組合的長壽群體、子女組中，各年齡段男性和女性的 TL均無顯著差別(P＞0.05);對照組的較高年齡段(65～年齡段)顯示男性RTL明顯長于女性(P=0.006)，同時(shí)總體人群、長壽組與對照組組合的普通人群在該年齡段也顯示男性RTL明顯長于女性RTL(P總體=0.024，P組合=0.006)，但這均由對照組的性別差異 形成的。

表3 各組別不同年齡段不同性別的RTL〔中位值(范圍)〕

3 討論

口腔黏膜脫落上皮細(xì)胞是在體細(xì)胞，它的采集方法簡單且相對無侵襲性，特別適用于參與者較多且年齡較大的特殊群體，其衰老在一定程度上可反映機(jī)體的衰老過程，因此已被用于人類衰老/長壽的研究?？谇火つっ撀渖掀ぜ?xì)胞DNA端粒長度與年齡〔6〕及年齡相關(guān)性疾病〔7，8〕的研究目前在國外已有不少報(bào)道。端粒是染色體末端的保護(hù)結(jié)構(gòu)，它的長度與人類(包括長壽老人)的生命壽限是密切相關(guān)的〔9〕，但由于缺乏有效的對照組使許多研究的結(jié)果不一致。與Atzmon等〔9〕的研究類似，我們將受試對象分為長壽組、子女組、對照組，其中子女組為長壽老人的第一代子女，對照組為年齡、性別與子女組相匹配且與長壽老人無血緣關(guān)系的同一地區(qū)具有相同生活背景的普通人群。這種有長壽趨勢的子女組及與子女組相匹配的對照組的選取為長壽表型的研究提供了有效的遺傳學(xué)對照。

本研究說明長壽群體的個(gè)體在進(jìn)入一定年齡后(本研究為65歲)TL縮短速率變慢，表明長壽群體對TL的維持可能存在特殊的機(jī)制，與Atzmon等〔9〕的研究類似。本研究中子女組在較高年齡段(65歲～年齡段)的RTL明顯長于同年齡段的對照組，而較低年齡段(＜65歲)RTL在子女組與對照組之間無差別，同時(shí)，長壽組(90歲～年齡段)的RTL與對照組高年齡段(65歲～年齡段)的RTL相當(dāng)，進(jìn)一步說明TL的遺傳性。這可能是生存差異所致高壽者擁有較長的端粒的原因，即各種年齡相關(guān)性疾病使端粒較短者死亡而被淘汰出自然人群，因逃避了此類疾病及其所致的端粒縮短而獲得高壽的個(gè)體，其端粒較長，再遺傳給子代，使子代也保持了較長的端粒。

Hayflick假說是指細(xì)胞分裂能力的有限性，體細(xì)胞端粒長度在DNA復(fù)制過程中的縮短支持了該假說，端粒的縮短已經(jīng)被認(rèn)為是一種生物鐘〔10，11〕。盡管其縮短速率有不同的報(bào)道〔10〕，但均隨著年齡的增長而縮短。本研究中，總體人群RTL與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)，即年齡越大，端粒長度越短，與其他學(xué)者的結(jié)果一致〔12～14〕，再次表明TL與衰老之間的密切關(guān)系，或換言之，TL可以當(dāng)作衰老的生物學(xué)標(biāo)記之一。

本研究的流行病學(xué)調(diào)查顯示長壽女性(71.1%)的數(shù)量遠(yuǎn)超于男性，這與 Tabatabaie 等〔15〕、Boyden 等〔16〕進(jìn)行的長壽群體研究是一致的，表明女性個(gè)體在長壽表型中有一定優(yōu)勢。M¨oller等〔10〕和Njajou等〔17〕報(bào)道女性的端粒長于男性，但本研究中長壽組、子女組的女性RTL并不長于男性，雖然流行病學(xué)調(diào)查顯示，長壽者中女性遠(yuǎn)多于男性，但長壽男性和女性之間的TL并無明顯區(qū)別，表明除TL的變化對衰老的影響外，高壽的獲得可能源自其他因素。對照組的高年齡段(65～年齡段)出現(xiàn)了男性RTL比女性長(P=0.006)，這可能是由于進(jìn)入更年期之后女性體內(nèi)的雌激素水平下降，與日本學(xué)者Guan等〔18〕的發(fā)現(xiàn)類似。但子女組并沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象，可能說明有長壽趨勢的個(gè)體體內(nèi)存在某種對抗雌激素下降的機(jī)制而維持女性在65歲年齡之后仍保持較高端粒水平，此問題值得進(jìn)一步探究。

1 Karin B，Jonas B，Karin P，et al.Constitutional short telomeres are strong genetic susceptibility markers for bladder cancer〔J〕.Carcinogenesis，2005;26(7)：1263-71.

2 Harley CB.Human ageing and telomeres〔J〕.Ciba Found Symp，1997;211(1)：129-39.

3 Simm A，Nass N，Bartling B，et al.Potential biomarkers of ageing〔J〕.Biol Chem，2008;389(3)：257-65.

4 von Zglinicki T，Martin-Ruiz CM.Telomeres as biomarkers for ageing and age-related diseases〔J〕.Curr Mol Med，2005;5(2)：197-203.

5 Cawthon RM.Telomere measurement by quantitative PCR〔J〕.Nucleic Acids Res，2002;30(10)：e47.

6 Hewakapuge S，van Oorschot RA，Lewandowski P，et al.Investigation of telomere lengths measurement by quantitative real-time PCR to predict age〔J〕.Leg Med(Tokyo)，2008;10(5)：236-42.

7 Thomas P，O'Callaghan NJ，F(xiàn)enech M.Telomere length in white blood cells，buccal cells and brain tissue and its variation with ageing and Alzheimer's disease〔J〕.Mech Ageing Dev，2008;129(4)：183-90.

8 Gadalla SM，Cawthon R，Giri N，et al.Telomere length in blood，buccal cells，and fibroblasts from patients with inherited bone marrow failure syndromes〔J〕.Aging(Albany NY)，2010;2(11)：867-74.

9 Atzmon G，Cho M，Cawthon RM，et al.Evolution in health and medicine Sackler cetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2010;107(Suppl 1)：1710-7.

10 M?ller P，Mayer S，Mattfeldt T，et al.Sex-related differences in length and erosion dynamics of human telomeres favor females〔J〕.Aging(Albany NY)，2009;1(8)：733-9.

11 Blackburn EH.Switching and signaling at the telomere〔J〕.Cell，2001;106(6)：661-73.

12 Slagboom PE，Droog S，Boomsma DI.Genetic determination of telomere size in humans：a twin study of three age groups〔J〕.Am J Hum Genet，1994;55(5)：876-82.

13 Kimura M，Hjelmborg JV，Gardner JP，et al.Telomere length and mortality：a study of leukocytes in elderly Danish twins〔J〕.Am J Epidemiol，2008;167(7)：799-806.

14 Njajou OT，Cawthon RM，Damcott CM，et al.Telomere length is paternally inherited and is associated with parental lifespan〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(29)：12135-9.

15 Tabatabaie V，Atzmon G，Rajpathak SN，et al.Exceptional longevity is associated with decreased reproduction〔J〕.Aging(Albany NY)，2011;3(12)：1202-5.

16 Boyden SE，Kunkel LM.High-density genomewide linkage analysis of exceptional human longevity identifies multiple novel loci〔J〕.PLoS One，2010;5(8)：e12432.

17 Njajou OT，Hsueh WC，Blackburn EH，et al.Association between telomere length，specific causes of death，and years of healthy life in health，aging，and body composition，a population-based cohort study〔J〕.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2009;64(8)：860-4.

18 Guan JZ，Maeda T，Sugano M，et al.Change in the telomere length distribution with age in the Japanese population〔J〕.Mol Cell Biochem，2007;304(1-2)：353-60.