益肺活血復方對人肺動脈內皮細胞微結構及內分泌功能的影響*

王 婷，歐 敏，黃友章

中國人民解放軍海軍總醫(yī)院干部呼吸科 北京100048

大量研究[1-2]表明，低氧造成的肺血管內皮細胞功能紊亂和平滑肌收縮是發(fā)生肺動脈高壓的主導因素。肺血管內皮細胞不僅是血管內壁的屏障，而且分泌釋放多種生物活性物質調節(jié)血管張力和平滑肌增殖，參與凝血劑抗血栓形成，影響血管通透性和物質交換。其中，內皮素-1(endothelin-1，ET-1)是內皮細胞分泌的最強的血管收縮因子，而內皮源性舒張因子主要為一氧化氮(nitric oxide，NO)和花生四烯酸代謝產物前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)。益肺活血復方是董建華院士臨床治療肺心病的一組中藥復方，既往研究[3-4]表明，在動物實驗水平上，益肺活血復方可抑制中膜增厚、減輕血管縮窄、降低肺動脈高壓。臨床上低氧常伴有二氧化碳的增高，因此該實驗采用體外低氧高二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)的人肺動脈內皮細胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)，研究益肺活血復方對HPAECs微結構及分泌ET-1、NO及PGI2的影響，從而探討其在肺動脈高壓治療中的作用。

1 材料與方法

1.1動物與細胞雄性新西蘭大耳白兔20只，清潔級，體質量(2.00±0.02) kg[北京市房山區(qū)官道順利養(yǎng)殖場提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0004]，以標準動物飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內環(huán)境溫度保持在18～29 ℃。HPAECs購自美國ScienCell公司。

1.2儀器及試劑低氧高二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液(美國M&G公司)，NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1及PGI2放射免疫測定試劑盒(北京華英生物技術研究所)。

1.3藥物益肺活血復方(黃芪100 g、潞黨參120 g、白術60 g、當歸90 g、桃仁120 g、紅花90 g、牛膝80 g、川芎50 g、赤芍60 g、陳皮70 g、柴胡50 g、桔梗50 g、枳殼60 g、甘草30 g、生地黃90 g)加重蒸水1 500 mL，同時煎沸20 min,過濾2次后合并2次濾液，4 000 r/min離心15 min后取上清液，濃縮至含生藥0.001 g/L。

1.4含藥血清的制備20只新西蘭大耳白兔采用隨機數(shù)字表法分為4組：空白對照組及低、中、高劑量益肺活血復方組，每組5只。每天2次分別以中藥低劑量(10 g/kg)、中劑量(20 g/kg)、高劑量(40 g/kg)灌胃，空白對照組以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)給藥2 h后腹主動脈采血，離心后分離血清，合并同組含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過濾后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細胞培養(yǎng)、分組及干預HPAECs于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞貼壁生長，呈多角形、鋪路石樣外觀；待細胞生長至80%融合后用胰蛋白酶消化傳代1次，方法參照美國ScienCell公司產品說明書。選用3～5代的細胞用于實驗。將HPAECs細胞懸液接種到含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞70%融合后，分組并干預?？瞻讓φ战M：體積分數(shù)21% O2、體積分數(shù)5% CO2條件下加入含體積分數(shù)10%空白對照組血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；模型組：體積分數(shù)5% O2、體積分數(shù)8% CO2條件下加入含體積分數(shù)10%空白對照組血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；低、中、高劑量益肺活血復方組：體積分數(shù)5% O2、體積分數(shù)8% CO2條件下加入含體積分數(shù)10%低、中、高劑量益肺活血復方組含藥血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。各組細胞分別培養(yǎng)12 h后收集細胞培養(yǎng)液上清或細胞用于檢測。

1.6細胞微結構的透射電鏡觀察共同孵育12 h后，各組細胞經PBS液漂洗3次后，用體積分數(shù)2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h，然后用10 g/L鋨酸4 ℃固定120 min，再進行梯度乙醇脫水、環(huán)氧丙烷置換及包埋，最后進行連續(xù)超薄切片及電鏡觀察。

1.7細胞培養(yǎng)液上清ET-1及PGI2含量的測定共同孵育12 h后，收集各組細胞培養(yǎng)液上清，置于-20 ℃冰箱儲存?zhèn)錅y。ET-1和PGI2測定均采用放射免疫法，嚴格按試劑盒說明進行操作。ET-1檢測靈敏度<0.005 pg/L，批內變異<10%，批間變異<15%。PGI2檢測靈敏度<0.025 pg/L，批內變異<3.5%,批間變異<10%。實驗重復6次。

1.8細胞培養(yǎng)液中NO含量的硝酸還原酶法測定

將生長良好的HPAECs接種于12孔培養(yǎng)板，待細胞生長至70%融合時，按1.5分組加不同的含藥血清干預，12 h后取細胞培養(yǎng)液100 μL，按照NO測定試劑盒說明進行操作。用721型分光光度計測定550 nm處的吸光度，并計算NO含量。實驗重復6次。

1.9統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0處理數(shù)據，采用單因素方差分析比較5組細胞培養(yǎng)液或培養(yǎng)液上清中ET-1、NO及PGI2含量的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1細胞微結構的透射電鏡觀察與空白對照組相比，透射電鏡下模型組可見細胞損傷，細胞膜不完整，胞質溶解，出現(xiàn)裸核，核周間隙擴張，核膜內外層之間分開；線粒體及內質網擴張，膜不完整。與模型組相比，低劑量益肺活血復方組細胞同樣呈現(xiàn)較重的細胞損傷，而中、高劑量益肺活血復方組細胞損傷較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 透射電鏡下各組HPAECs微結構的改變

2.2益肺活血復方含藥血清對HPAECs分泌ET-1、NO及PGI2的影響各組細胞處理12 h后，模型組ET-1含量高于空白對照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復方組ET-1含量減少。模型組NO和PGI2含量低于空白對照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復方組NO及PGI2含量增高。見表1。

表1 各組HPAECs細胞培養(yǎng)液或培養(yǎng)液上清中ET-1、NO及PGI2含量比較(n=6)

*:與空白對照組比較，P<0.01；#:與模型組比較，P<0.01。

3 討論

研究[5]表明，肺血管內皮細胞損傷在低氧性肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。肺血管內皮細胞不僅具有屏障功能，而且是許多血管活性物質合成、代謝的主要場所。低氧使血管內皮細胞水腫，甚至凋亡，導致細胞屏障功能受損；另一方面還導致內源性肺血管舒張和收縮物質分泌失衡。益肺活血復方是治療慢性肺心病的經驗方[3-4]。

低氧條件下內皮細胞水腫，失去正常排列，細胞質中出現(xiàn)顆粒，粗面內質網擴張，線粒體腫脹且嵴較模糊，胞質內出現(xiàn)巨大空泡；內皮細胞結構受損大大降低了細胞屏障功能。ET-1主要由內皮細胞分泌，在維持機體血管緊張性方面發(fā)揮重要作用，能引起強烈的血管收縮，促進平滑肌細胞、成纖維細胞的增殖，最終導致血管重塑和肺動脈高壓的形成。研究[6]發(fā)現(xiàn)，低氧能引起培養(yǎng)的血管內皮細胞ET-1基因轉錄和肽合成的增加。內皮細胞分泌的內皮源性舒張因子主要為NO和花生四烯酸代謝產物PGI2。肺血管內皮細胞產生的NO可迅速擴散進入血管平滑肌細胞，進而松弛平滑肌[7]。NO還可以直接抑制血管平滑肌細胞增生，抑制血管重塑[8-9]。王慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，低氧可導致大鼠肺血管內皮功能障礙，NO生成減少；而PGI2由表達于內皮細胞內質網和平滑肌細胞核膜及質膜上的前列環(huán)素合酶參與合成，具有較強的血管舒張和抗有絲分裂活性，現(xiàn)已廣泛運用于臨床治療肺動脈高壓。

該研究發(fā)現(xiàn)，低氧高二氧化碳造成HPAECs的細胞微結構受損，且低氧下HPAECs分泌的ET-1明顯高于常氧組，NO和PGI2明顯低于常氧組。而中、高劑量的益肺活血復方含藥血清能減輕細胞結構的損傷程度，減少HPAECs分泌ET-1，促進其分泌NO和PGI2。因此，作者推斷益肺活血復方可能通過減輕HPAECs結構損傷的程度從而改善其內分泌功能；或者益肺活血復方可直接影響內皮細胞血管活性物質生成的某個環(huán)節(jié)，并在肺動脈高壓的治療中發(fā)揮一定的作用。但其調控內皮細胞分泌功能的具體機制還需進一步研究。

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