宏基因組的生物信息分析

趙 勇，黃勁松，宋新蕊，陳禹保*，童貽剛

(1.北京市計(jì)算中心，北京100094;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京100071)

宏基因組學(xué)(metagenomics)是通過非微生物培養(yǎng)的方法對(duì)環(huán)境中微生物菌落進(jìn)行調(diào)查研究的一門新興學(xué)科，其主要研究對(duì)象為菌落中的細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和病毒等微生物，其主要目的是通過對(duì)微生物菌落中微生物的多樣性、種群結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)改變、各成員之間相互關(guān)系及與環(huán)境之間的相互關(guān)系等方面的分析，揭示更深層次的遺傳與進(jìn)化規(guī)律［1］。環(huán)境中微生物群落的研究經(jīng)歷了早期的以革蘭氏染色和微生物培養(yǎng)為主要技術(shù)的階段，由于微生物培養(yǎng)的瓶頸的存在，微生物群落的研究始終處于較初級(jí)的水平。DNA測(cè)序和PCR擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了人們對(duì)微生物群落的了解，以16/18S rRNA和OTU等為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)庫的建立與應(yīng)用，使廣大科研工作者能夠?qū)ξ⑸锞渲形锓N的多樣性和種群結(jié)構(gòu)等有更加深入的認(rèn)識(shí)［2］。2005年以來，DNA二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和生物信息學(xué)的發(fā)展，為微生物群落的研究注入了一股強(qiáng)大的動(dòng)力，宏基因組學(xué)漸漸走入了人們的視線并成為當(dāng)代生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)［3-8］。本文旨在通過對(duì)過去幾年來二代測(cè)序在宏基因組學(xué)研究方面應(yīng)用的總結(jié)，探討宏基因組學(xué)在未來的研究方向和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1 宏基因組學(xué)的研究進(jìn)展

宏基因組學(xué)的研究分為兩個(gè)階段，基于傳統(tǒng)的克隆和鳥槍法測(cè)序分析的宏基因組研究和基于二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代生物信息學(xué)分析的宏基因組研究階段。

1.1 傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)

傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)研究主要流程為:選擇性提取環(huán)境中的樣品，如土壤等，抽提樣品中的DNA/RNA，將樣品中的DNA片段化，使用克隆技術(shù)將DNA隨機(jī)連接到質(zhì)?；蛘沉５容d體，然后轉(zhuǎn)化細(xì)菌并篩選克隆，通過對(duì)插入片段的測(cè)序和功能性分析，從而達(dá)到對(duì)微生物菌落的基本了解。在PCR技術(shù)發(fā)明之后，對(duì)微生物菌落的研究，尤其是對(duì)其多樣性和種群結(jié)構(gòu)方面的研究，開始傾向于16 S/18 S rRNA的測(cè)序和分析［9］?？紤]到16 S/18 S rRNA測(cè)序和分析的分辨率不足以滿足分析的需求，操作分類單位(Operational taxonomic unit，OTU)開始引入微生物群落的多樣性分析［2］。由于微生物群落是一個(gè)多基因組的混合物，其中可能高達(dá)99%微生物不能單獨(dú)分離培養(yǎng)，對(duì)個(gè)體微生物基因組全面的功能性研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于微生物群落分類學(xué)的發(fā)展。另外，傳統(tǒng)的宏基因組分析費(fèi)用高，周期長，極大地限制了宏基因組學(xué)研究的發(fā)展。

1.2 基于二代測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)

以Roche 454和Illumina Hiseq為代表的二代測(cè)序技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了高通量和低費(fèi)用的有效結(jié)合，將宏基因組學(xué)研究推向了前臺(tái)。不同于第一代以Sanger末端終止法為原理的測(cè)序技術(shù)，二代測(cè)序技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的理念。Roche 454主要表現(xiàn)為通過檢測(cè)在合成過程中釋放的焦磷酸信號(hào)讀取基因的序列，Illumina則是通過讀取摻入染料的熒光信號(hào)獲得模板DNA的序列［10］。Roche 454最大的優(yōu)勢(shì)在于高質(zhì)量測(cè)序的讀長最長可達(dá)1 000 bp以上。Illumina Hiseq系列測(cè)序儀最大的特點(diǎn)是在較低費(fèi)用的基礎(chǔ)上一次測(cè)序產(chǎn)生最高可達(dá)600 G的數(shù)據(jù)量。近兩年來，Illumina推出的MiSeq則以簡單、快速、準(zhǔn)確受到部分終端用戶的好評(píng)［11］。

基于二代測(cè)序技術(shù)的宏基因組生物信息分析尚面臨很多挑戰(zhàn)。由于微生物群落包含物種的多樣性和復(fù)雜性，無論生物信息分析軟件和流程的開發(fā)，還是當(dāng)前電腦計(jì)算能力的有限性，都對(duì)得到精確的分析結(jié)果造成了相當(dāng)?shù)睦щy。例如，通常情況下的基因組測(cè)序是針對(duì)單一物種的基因組，而微生物菌落的宏基因組測(cè)序事實(shí)上沒有一個(gè)特定的范圍［6］。微生物群落各成員的豐度不一和基因序列的相似度差異較大等都對(duì)目前使用的軟件和分析方法構(gòu)成了相當(dāng)大的影響［3-4］。

2 宏基因組的生物信息學(xué)分析

總體來說，宏基因組學(xué)研究的問題是:1)微生物群落的成分及其動(dòng)態(tài)改變;2)微生物群落中的各種微生物的基因結(jié)構(gòu)及其功能;3)微生物群落的各個(gè)成員之間及其與環(huán)境或宿主之間的關(guān)系;4)微生物群落研究成果在現(xiàn)實(shí)生活中的應(yīng)用。

2.1 宏基因組的生物信息學(xué)分析內(nèi)容

微生物群落的多樣性分析:微生物群落中物種的多樣性依然是目前研究的重點(diǎn)。對(duì)群落結(jié)構(gòu)的研究，將有助于了解種群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而了解種群內(nèi)物種間的相互依賴、相互制約的內(nèi)在聯(lián)系，為將來構(gòu)建功能性種群服務(wù)。鑒于微生物群落是一個(gè)多物種的集合體，其中高達(dá)95%以上的微生物物種無法分離也不能獨(dú)立培養(yǎng)，拼裝出每個(gè)獨(dú)立個(gè)體的基因組現(xiàn)在也無法實(shí)現(xiàn)，16 S測(cè)序分析依然是現(xiàn)階段微生物群落多樣性和多態(tài)性分析的基石［4］。不可忽略的是，雖然基于PCR和高通量測(cè)序技術(shù)的微生物群落多樣性分析結(jié)果與傳統(tǒng)的鳥槍測(cè)序結(jié)果存在的偏差在可以接受的范圍內(nèi)［6］，但其物種的鑒別能力尚有很大的改善空間。因此，發(fā)現(xiàn)有效區(qū)分物種的基因標(biāo)記物仍是當(dāng)前需要追求的目標(biāo)之一。

微生物群落的成分分析:在物種多樣性分析的基礎(chǔ)上，一個(gè)微生物群落中物種的豐度和密度也是宏基因組學(xué)研究工作者共同關(guān)心的問題之一。某些物種豐度或密度的增減可能會(huì)改變種群的功能和特性［3］?；诟咄繙y(cè)序的數(shù)據(jù)分析，可以達(dá)到在個(gè)位數(shù)上了解微生物群落中物種的數(shù)目，使分析的結(jié)果更精確。對(duì)各個(gè)微生物種群隨著環(huán)境變化的動(dòng)態(tài)觀察，由于有效對(duì)照的缺失，結(jié)果往往不是十分精確;目前的成分分析結(jié)果大多是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的推測(cè)，唯有微生物群落的主成分分析和群落之間的主成分分析是相對(duì)可靠的。

微生物群落基因組組裝分析:相較于微生物個(gè)體的基因組而言，目前的高通量測(cè)序依然是小片段測(cè)序，微生物群落中各個(gè)微生物個(gè)體的基因組拼裝是當(dāng)前無法完成的任務(wù)［12］。如果能夠找到合適的方法，無疑將為開展微生物群落的研究提供極大的幫助。當(dāng)前宏基因組的拼裝原則上采用assembling、Blast search和ORF相結(jié)合的方法［7］。

微生物群落中個(gè)體的功能性分析:一個(gè)微生物個(gè)體在群落中的存在既有其偶然性，也有其必然性。近期受到廣泛關(guān)注的人的腸道微生物課題(Human microbial project)的研究顯示，腸道微生物群落中包含有與抗菌素的耐藥性、藥物的代謝和應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)的基因，這些基因?qū)λ幬锏拇x和人體的健康都有著很大的影響［13］。微生物和宿主之間的相關(guān)關(guān)系的研究也揭示出一些新的信號(hào)傳遞系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)［14］?；虻墓δ茴A(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證依然是需要解決的問題。單個(gè)基因的功能預(yù)測(cè)原則上依然是采用同源基因比對(duì)的原理，如Blast是基于序列比對(duì)，而pfam，HMM，CDD，COG等則是將基因序列與profile比對(duì)。

微生物群落的代謝通路分析:將微生物群落作為一個(gè)整體進(jìn)行代謝通路分析是一個(gè)新發(fā)展方向?，F(xiàn)有的代謝通路和信號(hào)傳遞系統(tǒng)都是基于單細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用級(jí)聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建的。微生物群落成員間、微生物群落和環(huán)境(或宿主)間存在有互動(dòng)，例如代謝產(chǎn)物的互享互助，如何有效的建立微生物群落的代謝通路是目前尚待解決的問題［14］。(見表1)。對(duì)于在線分析服務(wù)，如果不考慮數(shù)據(jù)的安全性，數(shù)據(jù)傳輸速度及數(shù)據(jù)處理的容量仍是進(jìn)行快速有效分析的限制因素。

2.3 宏基因組生物信息分析存在的問題

2.2 宏基因組常用生物信息分析軟件

各種生物信息學(xué)分析軟件有很多已經(jīng)被應(yīng)用于宏基因組的數(shù)據(jù)分析［26-27］，常規(guī)分析包括基因比對(duì)、序列裝配、基因預(yù)測(cè)、統(tǒng)計(jì)分析等(見表1)，這些分析都是根據(jù)數(shù)據(jù)的特性選擇合適的軟件并輔以適當(dāng)?shù)淖灾鏖_發(fā)腳本來完成。除上述可以獨(dú)立運(yùn)行的軟件外，有很多網(wǎng)站可以提供在線軟件分析服務(wù)當(dāng)前主流測(cè)序儀生成的數(shù)據(jù)原則上都需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，數(shù)據(jù)質(zhì)控的差異是造成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異的主要原因。數(shù)據(jù)的格式轉(zhuǎn)換則是目前解決得最好的內(nèi)容。對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)控形成一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)并非不可能，我們相信，隨著測(cè)序質(zhì)量的提高，業(yè)界將有望達(dá)成這個(gè)目標(biāo)。

盡管宏基因組數(shù)據(jù)存在多樣化的問題，高通量數(shù)據(jù)生物信息分析流程化仍然是目前的總體趨勢(shì)。流程化分析將有效增加數(shù)據(jù)分析的可靠性和結(jié)果間的可對(duì)比性。不可否認(rèn)的是當(dāng)前的數(shù)據(jù)分析流程多有一定的局限性和較高的錯(cuò)誤率，特別是在序列拼裝方面，但基于流程化的分析很容易通過相關(guān)參數(shù)的調(diào)整或軟件的升級(jí)提高分析的精度。

表1 宏基因組分析相關(guān)的常用軟件及網(wǎng)站Table 1 Metagenomics analysis related software and website

3 宏基因組研究的應(yīng)用前景

宏基因組研究有著廣泛的應(yīng)用前景，在理論研究和實(shí)際應(yīng)用中都有很重要的研究價(jià)值。其中主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:

進(jìn)化分析:研究顯示，物種之間的差異既有該物種本身基因組的差異，也有與其伴隨的微生物的差異，某些相關(guān)微生物與宿主之間是共生關(guān)系。水平基因轉(zhuǎn)移的發(fā)生是廣泛存在的現(xiàn)象還是在特定條件下的產(chǎn)物?物種間的共生關(guān)系導(dǎo)致物種間水平基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制及其意義的闡明將對(duì)生物物種的進(jìn)化理論產(chǎn)生重要的影響［23］。

基因發(fā)現(xiàn):基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)研究為新基因的發(fā)現(xiàn)打開了一條新的通路。就種類和數(shù)量而言，微生物都是最大的基因資源庫。傳統(tǒng)的方法是在基因裝配的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)基因的存在，然后通過同源基因的比對(duì)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來確認(rèn)基因的發(fā)現(xiàn)。對(duì)于宏基因組而言，由于測(cè)序的主要成分為多物種的混合物，基因組的裝配尚無法完成。無論基于現(xiàn)有的哪個(gè)軟件，所預(yù)測(cè)的基因的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證依然是個(gè)主要問題。宏基因組代謝與信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究是研究基礎(chǔ)最貧乏的方向，KEGG、IPA等數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建都是基于單一物種，多物種之間的信號(hào)傳導(dǎo)通路尚處于不明朗狀態(tài)，只能借鑒單一物種的數(shù)據(jù)。噬菌體是一類以特定細(xì)菌為宿主的病毒，在當(dāng)前抗生素耐藥菌泛濫而新的抗生素的研發(fā)遭遇瓶頸的情況下，新的噬菌體的發(fā)現(xiàn)有望為抗生素耐藥菌感染提供新的治療途徑。噬病毒體(virophage)［20-22］是近年來的一個(gè)新發(fā)現(xiàn)，由于病毒本身的生物特性，開發(fā)以噬病毒體為基礎(chǔ)的新藥很有可能為流感、AIDS等病毒源性疾病的治療帶來新的曙光。

環(huán)境與生態(tài)研究:微生物群落生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查，特別是環(huán)境微生物的存在與環(huán)境生態(tài)改變的關(guān)系，是當(dāng)前最受重視的課題之一［25］。目前的研究顯示，冷熱酸堿等極端環(huán)境都對(duì)環(huán)境微生物群落有著多種多樣的影響。在環(huán)境污染的情況下，某些特殊功能的微生物群落也許對(duì)于難以降解的污染具有特殊的功效。環(huán)境微生物的存在與農(nóng)業(yè)植物栽培和林業(yè)培育關(guān)系密切，固氮菌的存在對(duì)大豆生長的影響是農(nóng)業(yè)栽培的實(shí)例。地球微生物組計(jì)劃(Earth microbiome project)旨在廣泛的開展對(duì)環(huán)境中的微生物的研究，以達(dá)到造福全球和全人類的目的［30］。

疾病和個(gè)體化醫(yī)療:目前粗略估計(jì)人體內(nèi)微生物的數(shù)量是人的細(xì)胞數(shù)目數(shù)十倍甚至于百倍。大量的研究證據(jù)顯示，人體微生物的種群和多樣性與人體疾病的發(fā)生有著顯著的相關(guān)性，例如肥胖、心血管疾病和腫瘤等。人類微生物組計(jì)劃(Human microbiome project)的調(diào)查顯示，腸道微生物中存在大量與藥物代謝和分解相關(guān)的細(xì)菌，提示在個(gè)體化醫(yī)療方面不僅僅要考慮宿主基因組中藥物的代謝相關(guān)基因，同時(shí)也需要考慮到消化道中微生物群落的存在和組成［27］。

生物信息軟件研發(fā)和分析平臺(tái)構(gòu)建:隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，優(yōu)質(zhì)的第三代測(cè)序儀將面世并且發(fā)展勢(shì)頭強(qiáng)勁，其特性表現(xiàn)為:更高的測(cè)序通量，更精確的測(cè)序質(zhì)量，更長的測(cè)序長度。這些特性將為生物信息分析提出更多的需求。后兩個(gè)特性將使得宏基因組的拼裝成為可能，而前一個(gè)特性毫無疑問將需要電腦硬件和軟件的進(jìn)一步整合，否則，計(jì)算能力將成為分析的瓶頸［27］。

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