白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制

郭曉培，李艾芳，張寶旭，2，王 旗，2

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，北京 100191;2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點(diǎn)研究室，北京100191)

白鮮皮是蕓香科植物白鮮(Dictamnus dasycarpus)的根皮，為常用的傳統(tǒng)中藥。白鮮堿(dictamnine)是白鮮皮的主要成分之一，又稱白鮮胺或白蘚堿，屬呋喃喹啉類(lèi)生物堿，在白鮮皮中含量約0.1%[1]。白鮮堿能抑制血小板聚集、松弛血管并降低血壓等，具有抗菌、抗病毒和治療皮膚濕疹和皮膚瘙癢的作用[2－4]。2008 年，Jang 等[5]報(bào)道，韓國(guó)農(nóng)村地區(qū)患者連續(xù)服用白鮮堿水煎劑每日5～6次，連續(xù)數(shù)日，出現(xiàn)急性肝炎，提示白鮮皮具有潛在急性肝毒性。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，ig給予ICR小鼠白鮮皮水煎劑，小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶活性及總膽紅素明顯升高，并具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系;較高劑量白鮮皮給藥48 h后，小鼠肝組織出現(xiàn)大面積中心性壞死。白鮮皮中主要成分之一的白鮮堿單獨(dú)給藥達(dá)到一定劑量，也可致ICR小鼠發(fā)生急性肝損傷，ALT和LDH活性與對(duì)照組相比明顯升高(待發(fā)表)。上述體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白鮮堿具有潛在的肝毒性，可能是白鮮皮中的毒性成分。HepG2細(xì)胞來(lái)源于人肝胚細(xì)胞瘤，其所含的生物轉(zhuǎn)化代謝酶與人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有同源性，其分化程度較高，并且保留了較完整且活性穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化代謝酶，是研究藥物肝毒性常用的細(xì)胞模型之一[6－7]。本研究用HepG2細(xì)胞研究白鮮堿的肝毒性作用及其毒性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器

HepG2細(xì)胞，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。白鮮堿，中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):200301，純度≥98%);陽(yáng)性對(duì)照鹽酸胺碘酮(amiodarone，AD)和鹽酸普萘洛爾(propranolol hydrochloride，PPH)，天津一方科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)，北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司。Triton X-100和羅丹明123，Sigma公司;MEM培養(yǎng)基，北京清大天一生物科技有限公司;胰蛋白酶、MTT和 HEPES，Amresco公司;ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、LDH、谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(glutamyltranspeptidase，GGT)活性測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程有限公司。Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo公司;TE2000-S倒置顯微鏡和DXM1200F數(shù)字?jǐn)z像機(jī)，日本Nikon公司;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 kU·L－1、含 Earle 鹽和L-谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，24～48 h換液，每2～3 d傳代1次。用無(wú)水乙醇溶解白鮮堿，再用不含血清的MEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(3～5)×105L－1接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔200 μl。待12 h細(xì)胞完全貼壁以后，吸去上清液，分別加入不同濃度的白鮮堿 200 μl，其終濃度分別為 25，50，100，200，300，400，500 和 800 μmol·L－1，正常對(duì)照組為細(xì)胞加入等體積無(wú)血清培養(yǎng)基，溶劑對(duì)照組用等體積的1%無(wú)水乙醇代替白鮮堿，作用24 h。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=加藥組A490nm/正常對(duì)照組A490nm×100%。

1.3 LDH釋放率測(cè)定

細(xì)胞處理同1.2，白鮮堿的終濃度分別為2.5，5，12.5，25，50，100 和 200 μmol·L－1，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸取細(xì)胞上清液 20 μl，然后每孔加入 2%Triton X-100 溶液 200 μl，裂解細(xì)胞 1 h，吸取每孔裂解液20 μl，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量和細(xì)胞裂解液中LDH的含量，LDH釋放率(%)=細(xì)胞上清液中LDH含量/(細(xì)胞上清液LDH含量+細(xì)胞裂解液中LDH含量)×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞(3～5)×107L－1接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔1500 μl。待12 h細(xì)胞完全貼壁后，吸去上清液，分別加入白鮮堿1500 μl，終濃度分別為25，50，100和200 μmol·L－1，另設(shè)正常對(duì)照和溶劑對(duì)照組。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并拍照。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT，AST，GST和GGT活性測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)同1.2。白鮮堿的終濃度分別為25，50，100 和 200 μmol·L－1，每個(gè)濃度 4 個(gè)復(fù)孔，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測(cè)定 ALT，AST，GST和 GGT 活性的陽(yáng)性對(duì)照分別為 AD 25 μmol·L－1，AD 25 μmol·L－1，Triton X-10080 μmol·L－1和 PPH 125 μmol·L－1。培養(yǎng)時(shí)間分別為 24 h;24 h;4 和24 h及4，24和48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取上清液，按照ALT，AST，GST和GGT試劑盒方法進(jìn)行處理后，用酶標(biāo)儀分別在510 nm(ALT，AST和 GST)或410 nm(GGT)處測(cè)定每孔A值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT，AST，GST 和GGT含量。

1.6 線粒體膜電位的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化后種于共焦小皿中，細(xì)胞密度為 1 ×105L－1，每孔 500 μl，待12 h細(xì)胞完全貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入白鮮堿，終濃度分別為25，50，100 和200 μmol·L－1，正常對(duì)照和溶劑對(duì)照組同1.2，作用HepG2細(xì)胞24 h，陽(yáng)性對(duì)照為 CCCP 20 μmol·L－1作用 30 min，PBS 清洗2次，加入終濃度為2 mg·L－1的羅丹明123負(fù)載液500 μl，孵育20～30 min后，PBS 清洗2次覆蓋貼壁細(xì)胞，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察線粒體膜電位的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

如圖1所示，與正常對(duì)照和溶劑對(duì)照組相比，不同濃度的白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞存活率隨著濃度的增加而降低(r=0.965，P＜0.05)，800 μmol·L－1可使細(xì)胞存活率降至 10% 以下。用Origin8.0軟件擬合計(jì)算 IC50為(283±27)μmol·L－1。

2.2 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞膜的損傷

由表1 看出，白鮮堿在 12.5～50 μmol·L－1時(shí)引起HepG2細(xì)胞膜損傷，LDH釋放率較溶劑對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，但隨著白鮮堿濃度增加，LDH釋放率反而降低，與溶劑對(duì)照組無(wú)顯著差異。

Fig.1 Effect of dictamnine on survival of HepG2 cells.HepG2 cells were incubated with dictamnine 25，50，100，200，300，400，500 and 800 μmol·L －1for 24 h.The cell viability was examined by MTT assay.NC:normal control;SC:solvent(1%ethanol)control.Cell viability(%)=A490 nmof drug group/A490 nm of NC group.±s，n=5.

Tab.1 Effect of dictamnine on lactate dehydrogenase(LDH)release in HepG2 cells

2.3 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，HepG2細(xì)胞形狀無(wú)規(guī)則，處于增長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞增殖明顯，呈片狀生長(zhǎng)。白鮮堿作用HepG2細(xì)胞24 h，與正常對(duì)照和溶劑對(duì)照組相比，細(xì)胞數(shù)目明顯減少;白鮮堿濃度為100和200 μmo·lL－1時(shí)，細(xì)胞死亡漂浮的數(shù)量更多，細(xì)胞皺縮，散開(kāi)，脫落。

2.4 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞ALT和AST活性的影響

Fig.2 Effect of dictamnine on morphological changes of HepG2 cells(×100).See Tab.1 for the cell treatment.The morphological changes of HepG2 cells were observed under a contrast microscope.A:normal control;B:1%ethanol;C －F:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1，respectively.

Tab.2 Effect of dictamnine on alanine transaminase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activity in HepG2 cells

由表2看出，白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，與溶劑對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照AD 25 μmol·L－1組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性明顯升高(P＜0.05);白鮮堿 100 和200 μmol·L－1組 ALT 活性顯著升高(P＜0.05)，具有濃度依賴關(guān)系(r=0.995，P＜0.05);白鮮堿 25～200 μmol·L－1均使AST活性升高，且具有濃度依賴性(r=0.996，P＜0.05)。

2.5 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞GST活性的影響

如表3 所示，陽(yáng)性對(duì)照 Triton X-10080 μmol·L－1與HepG2細(xì)胞作用4和24 h，與其對(duì)應(yīng)的溶劑對(duì)照(0.4%DMSO)組相比，GST活性明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。白鮮堿 25 和 50 μmol·L－1與HepG2細(xì)胞作用4 h，GST活性與其對(duì)應(yīng)的溶劑對(duì)照(1%乙醇)組相比無(wú)明顯變化;100 和200 μmol·L－1時(shí)，GST活性明顯升高(P＜0.01);白鮮堿50～200 μmo·lL－1與HepG2細(xì)胞作用24 h，GST活性均明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。

Tab.3 Effect of dictamnine on glutathione S-transferase(GST)activity in HepG2 cells

2.6 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞GGT活性的影響

由表4可見(jiàn)，與1%乙醇溶劑對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照PPH和白鮮堿與HepG2細(xì)胞分別作用4和24 h，GGT活性均無(wú)明顯變化。與HepG2細(xì)胞作用48 h，與溶劑對(duì)照組相比，PPH和白鮮堿200 μmol·L－1組GGT活性明顯升高(P＜0.05)。

Tab.4 Effect of dictamnine on glutamyl transferase(GGT)activity in HepG2 cells

2.7 白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

由圖3和表5所示，白鮮堿與HepG2細(xì)胞作用24 h，羅丹明123的熒光強(qiáng)度隨著白鮮堿濃度的增加而逐漸下降，呈一定的濃度依賴關(guān)系(r=0.978，P＜0.05)，表明白鮮堿濃度越大，線粒體膜電位下降越多，線粒體膜損傷越嚴(yán)重。

Fig.3 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells determined with rhodamine 123(OI:×40;NA=1.25).See Tab.1 for the cell treatment.OI:oil immersion;NA:numerical aperture.A:normal control;B:1%ethanolo;C:carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone(CCCP)20 μmol·L－1for 30 min;D－G:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1for 24 h.

Tab.5 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential(ΔΨ)in HepG2 cells

3 討論

近年含有白鮮皮的中藥復(fù)方如青黛丸、消銀片、克銀丸、白癜風(fēng)膠囊、濕毒清膠囊和痔血膠囊等均有造成不同程度肝損傷的報(bào)道，引起各方面的關(guān)注。本研究觀察白鮮皮的主要成分之一白鮮堿的肝細(xì)胞毒性。MTT結(jié)果表明，白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞作用24 h，IC50值為(283±27)μmol·L－1，此結(jié)果與Schempp等[2]報(bào)道白鮮堿對(duì)人Jurkat細(xì)胞光毒性作用的 IC50為 245 μmol·L－1相近;但郭娜等[3]報(bào)道，白鮮堿對(duì)人脾細(xì)胞毒性作用的IC50≥1024 mg·L－1(約5.14 mmol·L－1);由此表明白鮮堿對(duì)不同類(lèi)型細(xì)胞的毒性不同。LDH是反映外源性化合物引起細(xì)胞膜損傷的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，白鮮堿在12.5～50 μmol·L－1時(shí)使 HepG2 細(xì)胞 LDH 釋放率增加，高于50 μmol·L－1時(shí)細(xì)胞的LDH釋放率與溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，這可能與細(xì)胞形態(tài)皺縮和數(shù)目減少有關(guān)。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變也發(fā)現(xiàn)，隨著白鮮堿濃度的增加，細(xì)胞皺縮，脫落，細(xì)胞數(shù)目迅速減少，漂浮的死亡細(xì)胞越來(lái)越多。

MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)的活性，SDH 是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶，為反映線粒體活性的一種標(biāo)志酶。白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞存活的影響呈濃度依賴關(guān)系，提示HepG2細(xì)胞線粒體活性隨白鮮堿濃度的增大而降低，這與本研究檢測(cè)的線粒體膜電位隨白鮮堿濃度的增大而下降趨勢(shì)是一致的。肝是體內(nèi)含酶最豐富的器官，也是酶代謝的主要場(chǎng)所，當(dāng)肝受損傷時(shí)，肝細(xì)胞膜通透性增加，肝細(xì)胞內(nèi)的酶外漏，導(dǎo)致血清中酶的活性增高。ALT存在于細(xì)胞質(zhì)，AST主要存在于線粒體。已有研究表明，AD對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性與其引起ALT和AST活性變化有關(guān)[8－9]。因此本研究選用AD作為檢測(cè)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的陽(yáng)性對(duì)照。本研究結(jié)果表明，白鮮堿較高濃度(100 和 200 μmol·L－1)能引起HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT活性升高，而白鮮堿低濃度25 μmol·L－1即導(dǎo)致 AST 活性升高，并呈濃度依賴關(guān)系，且AST活性升高幅度比ALT更明顯。此結(jié)果表明，白鮮堿可引起線粒體中的AST外泄，伴隨細(xì)胞質(zhì)中的ALT漏出。

HepG2細(xì)胞的特點(diǎn)為主要表達(dá)Ⅱ相代謝酶，GST是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化重要的Ⅱ相代謝酶之一。GST亦稱為膽紅素結(jié)合蛋白，由于其分子質(zhì)量較ALT小，易穿過(guò)受損的細(xì)胞膜溢出胞外，在肝細(xì)胞膜受損時(shí)其升高先于ALT的升高，反映細(xì)胞毒性更加敏感。GGT在肝中主要在肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生，而且對(duì)肝毒性的特異性高。因此，本研究深入探討白鮮堿對(duì) HepG2細(xì)胞 GST和 GGT活性的影響。Gerets等[10]報(bào)道，一定劑量的Triton X 100能引起HepG2細(xì)胞中α-GST活性升高。也有研究報(bào)道，一定濃度的AD作用于細(xì)胞后，肝細(xì)胞受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，GGT活性特異性地升高[11]。本研究中不同濃度的白鮮堿分別作用4和24 h，較高濃度白鮮堿100 和200 μmol·L－1可使 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)液中的GST活性升高。作用時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，可使細(xì)胞培養(yǎng)液中GGT活性升高。該結(jié)果提示，白鮮堿在達(dá)到一定濃度和時(shí)間后，可造成HepG2細(xì)胞中GST和GGT的釋放，GST活性的敏感性更高，作用短時(shí)間即受到影響。

綜上所述，白鮮堿對(duì)HepG2細(xì)胞具有毒性，白鮮堿的毒性作用涉及線粒體活性的變化和細(xì)胞膜損傷，伴隨多種酶活性的改變。

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