雌激素受體與Ⅱ型膠原在人胚髁突軟骨中的表達

張躍蓉　龐磊　劉忠林

[摘要] 目的 探討雌激素受體（ER）和Ⅱ型膠原在人胚髁突軟骨中的表達情況。方法 采用蘇木精-伊紅（HE）及免疫組織化學(xué)染色法檢測ERα、ERβ和Ⅱ型膠原在人胚顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨各層的表達。結(jié)果 Ⅱ型膠原主要表達于髁突軟骨的過渡層及肥大層。ERα主要表達于髁突軟骨的過渡層及肥大層，均勻分布于細胞內(nèi)；ERβ集中表達于肥大層，且以細胞核內(nèi)分布為主。纖維層及增殖層未見Ⅱ型膠原和ER表達，鈣化軟骨層有少量表達。結(jié)論 ER與Ⅱ型膠原在髁突軟骨中分布一致，雌激素可選擇性地結(jié)合不同亞型的ER，從而調(diào)節(jié)髁突軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原的能力。

[關(guān)鍵詞] 髁突軟骨； 雌激素； 雌激素受體； 人胚

[中圖分類號] R 322.4+1 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.020

大量的臨床病例和流行病學(xué)調(diào)查表明，雌激素水平的變化可能是導(dǎo)致顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。╰empo-romandibular joints disorders，TMD）的重要原因之一。雌激素發(fā)揮生理作用需要雌激素受體（estrogen receptor，ER）的介導(dǎo)，既往研究顯示，動物和人的關(guān)節(jié)均有雌激素受體的表達，證明關(guān)節(jié)是雌激素作用的靶器官。顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）的結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，并且終生進行適應(yīng)性改形重建，雌激素對TMJ的效應(yīng)是否與其他關(guān)節(jié)相同，目前尚不明確。本研究應(yīng)用蘇木精-伊紅（hematoxy-lin-eosin，HE）及免疫組織化學(xué)染色法觀察ER以及間質(zhì)膠原在人胚髁突軟骨中的表達，并分析兩者的重疊關(guān)系，以期為TMD的發(fā)病機制研究以及臨床合理應(yīng)用雌激素治療TMD提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗標本、試劑及儀器

髁突軟骨取自因母體健康原因水囊引產(chǎn)并自愿捐獻的4～5月齡胚胎。ERα多克隆抗體、ERβ多克隆抗體、檸檬酸鈉抗體修復(fù)液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體、通用型二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒、山羊血清封閉液、胃蛋白酶消化液、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），倒置相差顯微鏡（Olympus IX71）、Image-Pro Express6.0成像系統(tǒng)（Olympus公司，日本），自動顯微照相裝置（Qimaging公司，加拿大）。

1.2 髁突軟骨ΗΕ染色

軟骨切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化組織切片。蘇木精染色4 min，流水沖洗多余染液。1%鹽酸乙醇分化5 s，流水沖洗，40 ℃溫水返藍10 min。伊紅染色30 s，流水沖洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，風(fēng)干，中性樹膠封固。

1.3 Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色

髁突軟骨切片分成2組，常規(guī)脫蠟水化，滴加3%過氧化氫避光孵育15 min，胃蛋白酶消化30 min，山羊血清封閉30 min，滴加鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（一抗，即用型）及PBS作為陰性對照組，4 ℃孵育過夜，滴加通用型二抗，DAB顯色，常規(guī)封固拍照。

1.4 ER免疫組織化學(xué)染色

髁突軟骨切片分成3組，常規(guī)脫蠟水化，滴加3%過氧化氫避光孵育15 min，檸檬酸鈉抗原熱修復(fù)兩次，山羊血清室溫封閉30 min，分別滴加ERα多克隆抗體（一抗10 μg·mL-1）、ERβ多克隆抗體（一抗10 μg·mL-1），滴加PBS作為陰性對照組，4 ℃孵育過夜，滴加通用型二抗，DAB顯色，常規(guī)封固拍照。

2 結(jié)果

2.1 人胚髁突解剖形態(tài)觀察

4～5月齡胚胎下頜骨呈粉白色，透光可見紅色骨髓，骨質(zhì)較薄韌性尚存，未完全骨化。下頜體與下頜升支相交呈鈍角，下頜升支分成喙突與髁突，兩突相交呈“U”形，在乙狀切跡處匯合。髁突內(nèi)外徑大于前后徑，頸部短小，表面覆蓋中央凹陷的關(guān)節(jié)盤，后斜面大于前斜面，位置略高于前斜面（圖1）。

圖 1 人胚髁突

Fig 1 Mandibular condylar cartilage of human embryo

2.2 人胚髁突軟骨HE染色觀察

髁突軟骨從關(guān)節(jié)表面至深層可分為5層。纖維層：9～11層細胞，細胞核染成藍色，呈卵圓形或梭形；增殖層：5～6層小而密集的細胞，細胞形態(tài)從細長三角形逐漸演變成扁平三角形；過渡層：5～7層，呈扁平三角形或橢圓形的細胞；肥大層：10～

11層軟骨細胞；鈣化軟骨層：12～13層細胞，接近骨組織處，細胞體積最大，細胞質(zhì)呈空泡狀，細胞核染成藍色位于中央，不規(guī)則地皺縮呈橢圓形或三角形（圖2）。

F：纖維層；P：增殖層；T：過渡層；C：肥大層；K：鈣化軟骨層。

圖 2 人胚髁突軟骨 HE × 100

Fig 2 Mandibular condylar cartilage of human embryo HE × 100

2.3 人胚髁突軟骨Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察

Ⅱ型膠原在人胚髁突軟骨呈不均質(zhì)性表達：髁突軟骨纖維層、增殖層可見小而密集的細胞，細胞核染成深藍色，細胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)染成極淺的藍色，不易分辨；過渡層的細胞外基質(zhì)染成較淺的棕黃色，細胞核染成深藍色，細胞質(zhì)染成淺藍色，細胞與細胞外基質(zhì)界限清晰；肥大層細胞外基質(zhì)染成大片棕黃色，與細胞界限清晰，細胞質(zhì)與細胞核均染成藍色；鈣化軟骨層胞外基質(zhì)較少，可見少量條狀異染棕黃色基質(zhì)，細胞質(zhì)與細胞核呈空泡狀，染成藍色，細胞質(zhì)與細胞核界限不清（圖3左）。陰性對照組全部染成藍色（圖3右）。

左：Ⅱ型膠原；右：陰性對照。

圖 3 人胚髁突軟骨 免疫組織化學(xué) × 100

Fig 3 Mandibular condylar cartilage of human embryo immuno-

histochemistry × 100

2.4 人胚髁突軟骨ERα、ERβ免疫組織化學(xué)染色觀察

髁突軟骨的纖維層、增殖層未見ER表達；過渡層可見大量ERα表達，ERα在細胞內(nèi)分布均勻，細胞質(zhì)可見棕黃色的異染基質(zhì)，部分細胞核也被異染成棕黃色，未見ERβ表達；肥大層ERα、ERβ均有大量表達，細胞質(zhì)與細胞核均被異染成棕黃色，而ERβ集中表達在細胞核；鈣化軟骨層ERα、ERβ也有少量表達，皺縮的細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)均可見棕黃色異染基質(zhì)，此層兩種受體表達未見明顯差異，細胞外基質(zhì)染成藍色，顏色較前幾層深（圖4、5），陰性對照組全部染成藍色。

左：ERα；右：ERβ。F：纖維層；P：增殖層；T：過渡層；C：肥大層；K：鈣化軟骨層。

圖 4 人胚髁突軟骨 免疫組織化學(xué) × 200

Fig 4 Mandibular condylar cartilage of human embryo immuno-

histochemistry × 200

左：ERα；右：ERβ。箭頭所示為染色陽性細胞。

圖 5 人胚髁突軟骨肥大層 免疫組織化學(xué) × 400

Fig 5 Hypertrophic layers of mandibular condylar cartilage of hu-

man embryo immunohistochemistry × 400

3 討論

髁突是顳下頜關(guān)節(jié)的重要組成部分，TMJ行使正常的生理功能與髁突軟骨密切相關(guān)[1]。作為繼發(fā)型纖維軟骨，髁突軟骨組織學(xué)特征與始基軟骨極為相似[2]，以往學(xué)者[3-5]對髁突軟骨的組織分層尚未形成一致，多認為髁突軟骨由淺入深分為四個帶，而谷志遠等[6]通過免疫組織化學(xué)、原位雜交以及透射電鏡方法發(fā)現(xiàn)，增殖層淺層和深層在功能和形態(tài)上均有不同，增殖深層已向軟骨細胞過渡，故認為將其分為2層更合理，藉此將髁突軟骨分為5層。本實驗結(jié)果顯示：髁突軟骨由淺及深，其細胞形態(tài)從細長三角形向扁平三角形變化，最終演變?yōu)闄E圓形的肥大細胞，細胞體積明顯增大，胞漿豐富；功能上分泌細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的能力也是從無到有，逐漸增強，Ⅱ型膠原強表達于過渡層和肥大層，這與谷志遠等的研究結(jié)果一致，由此再次證明髁突軟骨主要功能區(qū)存在于過渡層及肥大層。

雌激素是機體內(nèi)非常活躍的一類激素，雌激素的各種作用必須通過細胞內(nèi)特異的性激素結(jié)合球蛋白介導(dǎo)，即雌激素與ER結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。ER是甾體激素受體大家族中的一種，為核受體。目前發(fā)現(xiàn)雌激素受體可分為ERα和ERβ兩種亞型，這兩種受體的天然配體都是雌激素，兩者能以相似但不同的親和力與雌激素結(jié)合，且ERα和ERβ在分布上也存在明顯的差異。1985年Sheridan等[7]首先用放射性自顯影方法證實了成年雌性狒狒髁突軟骨中存在雌激素受體，之后國內(nèi)外學(xué)者就ER不同亞型在動物模型上的表達展開了研究，Wang等[8]提取了體外培養(yǎng)的大鼠TMJ纖維軟骨細胞ER總蛋白，發(fā)現(xiàn)ERα表達高于ERβ；于世賓等[9]發(fā)現(xiàn)ERα分布較廣，在細胞核及細胞質(zhì)中分布均勻，而ERβ僅側(cè)重于細胞核的表達。國內(nèi)研究也得出相似的結(jié)論。免疫細胞化學(xué)和原位雜交的方法發(fā)現(xiàn)：在TMJ的滑膜襯里細胞、關(guān)節(jié)盤基質(zhì)細胞和軟骨細胞中，ERα有強免疫反應(yīng)，且主要表達于細胞核，胞漿僅弱表達。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察人胚顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨ER受體的分布，發(fā)現(xiàn)ER主要表達在髁突軟骨的過渡層和肥大層，其中，ERα分布范圍廣，過渡層、肥大層、鈣化軟骨層均有表達，ERβ僅在肥大層和鈣化軟骨層表達，增殖層及纖維層尚未發(fā)現(xiàn)ERα、ERβ表達；ERα在細胞內(nèi)均勻分布，而ERβ集中表達在細胞核內(nèi)，表明ERα比ERβ分布更廣泛。這提示TMJ是作為雌激素作用的靶器官，其ER介導(dǎo)的作用機制可能不盡相同[10]。

Ⅱ型膠原是髁突軟骨細胞外基質(zhì)的重要組成成分，構(gòu)成髁突軟骨的基本骨架結(jié)構(gòu)，其主要功能是維持軟骨的強度和結(jié)構(gòu)的完整性，進而保證髁突軟骨正常生理功能的發(fā)揮。研究表明雌激素水平與軟骨基質(zhì)的合成及降解有關(guān)，雌激素可以抑制軟骨細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），并可改善 MMP與金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）之間的平衡協(xié)調(diào)。另有研究表明，隨去勢后關(guān)節(jié)軟骨的ER表達水平降低，軟骨組織中的MMP表達逐漸增高，使MMP與TIMP的平衡被打破，從而導(dǎo)致Ⅱ型膠原代謝增加，軟骨基質(zhì)破壞。本實驗結(jié)果證明：雌激素受體與Ⅱ型膠原均主要表達在髁突的過渡層和肥大層，且這些位點正是髁突軟骨代謝最活躍的中心，推測雌激素可選擇性地與不同亞型ER結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)髁突軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原的能力，從而影響顳下頜關(guān)節(jié)的軟骨代謝功能，對顳下頜關(guān)節(jié)行使功能產(chǎn)生影響。

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（本文編輯 李彩）