果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中甘露糖產(chǎn)生的研究

劉 佳， 張曉萍， 段 鋼

（杰能科（中國(guó)）生物工程有限公司 杜邦工業(yè)生物科技，江蘇 無(wú)錫 214028）

果葡糖漿是由果糖和葡萄糖及其它少量的糖類(lèi)所組成的混合物，是一種以淀粉為主要原料、運(yùn)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)的健康型糖源[1]。果葡糖漿主要應(yīng)用于食品工業(yè)，也有少量高純果糖可應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)。在食品工業(yè)中主要應(yīng)用于軟飲料行業(yè)、乳制品行業(yè)、罐頭工業(yè)、糕點(diǎn)行業(yè)等。隨著對(duì)果葡糖漿優(yōu)越性的深入了解，其應(yīng)用領(lǐng)域更加廣泛，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量也在不斷增加，質(zhì)量要求也越來(lái)越高。

作者在分析客戶(hù)樣品過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在一些果葡糖漿中存在一定量的甘露糖，所占比例從0.2%到1.5%不等。根據(jù)可口可樂(lè)公司對(duì)F55型果葡糖漿的質(zhì)量要求，即果糖最小含量為55%，果糖與葡萄糖含量不小于95%。在一些F55果糖樣品中，由于存在甘露糖，雖然果糖含量滿(mǎn)足要求，單糖含量也在95%以上，但果糖與葡萄糖含量之和小于95%。由于可口可樂(lè)公司的要求中并不是指單糖含量，因此這種產(chǎn)品實(shí)際上是不符合要求的。由于F55果糖是由F90果糖和F42果糖混配而成，為了滿(mǎn)足要求就需要提高F90的比例。因此研究果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中甘露糖產(chǎn)生的原因具有重要意義。

通過(guò)仔細(xì)分析含有甘露糖的樣品后發(fā)現(xiàn)，其主要產(chǎn)生在兩個(gè)過(guò)程之后，一個(gè)是在異構(gòu)化之后，另一個(gè)是在第二次離子交換之后，即F42果糖離交后。葡萄糖異構(gòu)酶的來(lái)源較多，商業(yè)化的酶主要來(lái)源于Bacillus和streptomyces[2]，可以催化葡萄糖、果糖，木糖、木酮糖之間的異構(gòu)反應(yīng)。由于對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶的研究多集中在底物特異性及提高反應(yīng)穩(wěn)定性等方面，因而對(duì)副反應(yīng)產(chǎn)物的報(bào)道很少。此外果糖、葡萄糖易在堿性條件下，由于旋光改變作用發(fā)生分子重排和降解，通過(guò)烯二醇作為中間物可以實(shí)現(xiàn)果糖、葡萄糖和甘露糖之間的互相轉(zhuǎn)化[3-4]，此反應(yīng)又稱(chēng)為L(zhǎng)obry de Bruyn-Alberda van Ekenstein轉(zhuǎn)化，并且在此過(guò)程中單糖部分降解，產(chǎn)生少量有色物質(zhì)等其它產(chǎn)物。而在生產(chǎn)過(guò)程中，果葡糖漿需要使用離子交換樹(shù)脂進(jìn)行純化，離子交換樹(shù)脂使用堿液進(jìn)行再生，再生后清洗不徹底，容易造成局部過(guò)堿，從而發(fā)生此反應(yīng)生成甘露糖。

作者研究了葡萄糖異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響，以及葡萄糖、果糖在不同堿性pH值條件下單糖旋光改變和降解反應(yīng)的情況，比較了不同環(huán)境下葡萄糖和果糖含量變化對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響，同時(shí)檢測(cè)了反應(yīng)體系中產(chǎn)生的其它產(chǎn)物。為研究果葡糖漿中甘露糖和其它雜質(zhì)的產(chǎn)生原因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄糖，果糖，氫氧化鈉和硫酸：國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；葡萄糖，果糖，甘露糖，甲酸，乙酸，乙酰丙酸，糠醛和5-羥甲基糠醛：Sigma公司產(chǎn)品；異構(gòu)酶1和異構(gòu)酶2：市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響 25 g葡萄糖漿（客戶(hù)樣品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，pH 7.4，Mg2+質(zhì)量濃度45 mg/kg）中加入2 g異構(gòu)酶，于60℃水浴保溫，分別于24 h及48 h取樣分析。對(duì)照實(shí)驗(yàn)以分析純葡萄糖加蒸餾水配置成相同濃度的糖漿，并調(diào)節(jié)pH及鎂離子質(zhì)量濃度相同，加入同樣比例異構(gòu)酶，60℃反應(yīng)，于24 h和48 h取樣分析。

1.2.2 不同堿性pH值條件下果糖及果糖和葡萄糖混合物的反應(yīng) 用分析純果糖和葡萄糖加水配成100 g/L 3種溶液，溶液中果糖濃度分別為100%、42%和20%。分別取10 mL上述溶液加入50 mL塑料離心管中，并加入10 mL不同濃度的NaOH溶液，使最終溶液體系成為6個(gè)不同pH值的50 g/L 100%果糖、42%果糖和20%果糖溶液。6個(gè)pH值分別 為 pH 7，pH 8.5，pH 10，pH 11，pH 12 和 pH 12.8。將離心管蓋上蓋子后放入60℃水浴進(jìn)行反應(yīng)，在0，4，7和23 h分別進(jìn)行取樣分析。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖，果糖和甘露糖分析 使用帶有示差檢測(cè)器的安捷倫1260 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，色譜柱：Phenomenex RezexTMCalcium Monosaccharide（RCM）（300×7.8 mm）；柱溫 80 ℃；流動(dòng)相純水；流量0.6 mL/min；示差檢測(cè)器溫度40℃。

1.3.2 有機(jī)酸分析 使用帶有示差檢測(cè)器的安捷倫1100 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，色譜柱：Phenomenex RezexTMOrganic Acid （300 mm×7.8 mm）； 柱溫 60℃；流動(dòng)相 0.005 mol/L H2SO4；流量 0.6 mL/min；示差檢測(cè)器溫度30℃。

1.3.3 反應(yīng)體系吸光度分析 使用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定樣品的A值。

2 結(jié)果與討論

2.1 異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響

以客戶(hù)的異構(gòu)進(jìn)料樣為底物，其中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.38%，考察了葡萄糖異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示，底物自身幾乎不含甘露糖，當(dāng)糖液中不添加葡萄糖異構(gòu)酶，24 h后僅有微量甘露糖產(chǎn)生，而加入葡萄糖異構(gòu)酶24 h后，生成大量甘露糖。通常認(rèn)為甘露糖是果糖在堿性條件下通過(guò)Lobry de Bruyn-van Ekenstein途徑產(chǎn)生，也有研究認(rèn)為在中性或酸性條件下，果糖也能夠轉(zhuǎn)化為甘露糖，但需要較長(zhǎng)時(shí)間。在工業(yè)生產(chǎn)中，果糖異構(gòu)反應(yīng)的pH通常控制在7.3附近，此時(shí)果糖的Lobry de Bruyn-van Ekenstein轉(zhuǎn)化速率慢，因此添加異構(gòu)酶后所產(chǎn)生的甘露糖僅有極小部分是通過(guò)此反應(yīng)產(chǎn)生，大部分應(yīng)來(lái)源于異構(gòu)酶的副反應(yīng)活力。

為了進(jìn)一步了解異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響，實(shí)驗(yàn)使用了兩種商品化的異構(gòu)酶，考察其影響，結(jié)果如圖1所示。異構(gòu)酶1和異構(gòu)酶2是兩種商業(yè)化多年的葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)品，從圖1可以看出兩者在異構(gòu)過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生甘露糖。對(duì)于異構(gòu)酶1，反應(yīng)24 h后，甘露糖增加3倍，24 h后雖然甘露糖濃度仍然在增加，但速度減慢。對(duì)于異構(gòu)酶2，24 h后甘露糖增加了3.4倍，同樣其產(chǎn)生速度也在24 h后大幅降低。果糖與甘露糖的比值在一定程度上反應(yīng)了異構(gòu)酶對(duì)于主反應(yīng)的選擇性，由于兩種異構(gòu)酶產(chǎn)生甘露糖的能力有所不同，從而表現(xiàn)在主反應(yīng)的選擇性上也有所區(qū)別。但這種區(qū)別在底物被更換為分析純葡萄糖配制的糖漿時(shí)表現(xiàn)的不明顯。以分析純葡萄糖為底物，反應(yīng)24 h甘露糖的產(chǎn)生量減少了30.3～33.7%（圖2），而果糖與甘露糖的比值則提高41.5～51.0%，由此可見(jiàn)提高底物純度不僅能夠降低甘露糖產(chǎn)生，也有利于提高異構(gòu)反應(yīng)的選擇性。

圖1 不同異構(gòu)酶對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響Fig.1 Effect of different glucose isomerase on mannose formation

圖2 以葡萄糖為底物時(shí)甘露糖的產(chǎn)生Fig.2 Mannose formation using glucose as substrate

果葡糖漿的生產(chǎn)是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，葡萄糖漿從異構(gòu)柱進(jìn)口進(jìn)入，到F42果糖從出口流出的線速度通常為幾毫米/秒[5]，所需時(shí)間并沒(méi)有24 h，因此在正常的生產(chǎn)中，并不會(huì)有太多的甘露糖在異構(gòu)之后產(chǎn)生。但果糖生產(chǎn)存在淡、旺季之分，在淡季，工廠通常會(huì)封柱，或是將流速降至極低，這樣就使得酶與糖漿的接觸時(shí)間大大增加，因此在剛恢復(fù)正常流量時(shí)，會(huì)在異構(gòu)出口處的樣品中檢測(cè)到較多的甘露糖。此外有些工廠在將異構(gòu)酶裝填進(jìn)異構(gòu)柱之前，會(huì)先對(duì)酶進(jìn)行水化，水化時(shí)間通常需要數(shù)小時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生一定量的甘露糖。

2.2 不同堿性pH值對(duì)果糖及果糖和葡萄糖混合物反應(yīng)的影響

2.2.1 不同堿性pH值對(duì)甘露糖合成的影響 為了研究離子交換樹(shù)脂中殘留堿液對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響，作者使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%果糖和42%、20%果糖含量的果葡糖漿作為底物，觀察其在不同堿性pH條件下甘露糖的合成情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值對(duì)甘露糖產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of different alkali pH values on mannose formation

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%果糖作為反應(yīng)底物時(shí)，在pH 7～10條件下反應(yīng)體系只有微量甘露糖合成（甘露糖含量小于0.1 g/L）。當(dāng)pH大于10后，甘露糖含量大幅提高，尤其在4 h后。當(dāng)pH為12.8反應(yīng)4 h后，甘露糖含量接近7 g/L。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)42%果糖的果糖和葡萄糖混合物作為反應(yīng)底物時(shí)，在pH 7～10條件下，在取樣時(shí)間內(nèi)沒(méi)有明顯甘露糖合成，當(dāng)pH大于11后，0 h的樣品中可檢測(cè)到甘露糖。當(dāng)pH為12.8，0 h的樣品中可測(cè)得1.5 g/L左右甘露糖，反應(yīng)4 h以后，其含量達(dá)到6 g/L，這與相同條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%果糖作為底物時(shí)相比略低。而以質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%果糖含量的混合物作為底物時(shí)，產(chǎn)生的甘露糖變化曲線與另外兩種底物類(lèi)似，但甘露糖合成量比質(zhì)量分?jǐn)?shù)42%果糖含量的底物更低一些。由此可見(jiàn)，甘露糖的產(chǎn)生與環(huán)境pH值和接觸時(shí)間密切相關(guān)，環(huán)境pH越高，果糖產(chǎn)生甘露糖的時(shí)間越短，當(dāng)pH大于11后，接觸瞬間既有少量甘露糖產(chǎn)生，因此在離子交換過(guò)程中，如果樹(shù)脂堿性再生后沒(méi)有清洗干凈，造成局部pH過(guò)高，糖漿接觸之后就會(huì)產(chǎn)生甘露糖，因此樹(shù)脂再生后清洗干凈有助于減少離子交換過(guò)程中甘露糖的產(chǎn)生。

2.2.2 不同堿性pH值對(duì)其它雜質(zhì) （有機(jī)酸和有色物質(zhì)）合成的影響 上述果糖和葡萄糖體系在反應(yīng)23 h時(shí)測(cè)定其pH值發(fā)現(xiàn)均有一定程度的下降，且均可降至pH 7以下。單糖在酸性條件下易發(fā)生降解反應(yīng)產(chǎn)生有機(jī)酸及其它一些產(chǎn)物，其中有些降解產(chǎn)物，如糠醛、5-羥甲基糠醛（5-HMF）會(huì)影響果葡糖漿的風(fēng)味，因此除甘露糖含量外，作者還測(cè)定了上述底物在不同pH條件下23 h時(shí)反應(yīng)體系中甲酸、乙酸、乙酰丙酸、糠醛和5-HMF的含量，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH值下反應(yīng)23 h對(duì)有機(jī)酸合成的影響Fig.4 Effect of different alkali pH values on organic acid formation after 23 hours

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)上述反應(yīng)體系中無(wú)乙酰丙酸和糠醛檢出。100%果糖和42%果糖作為反應(yīng)底物時(shí)，甲酸在初始pH大于7的反應(yīng)體系中均可產(chǎn)生；20%果糖作為反應(yīng)底物時(shí)，甲酸在初始pH大于10以后才開(kāi)始合成。在初始pH為12.8時(shí)3種不同果糖含量反應(yīng)底物的甲酸含量接近，可達(dá)1.5 g/L。3種不同果糖含量反應(yīng)底物均在初始pH大于11后才開(kāi)始合成乙酸，且3種反應(yīng)底物在初始pH為12.8時(shí)乙酸合成量非常接近，均可達(dá)1.6 g/L。在初始pH大于12時(shí)5-HMF開(kāi)始合成，且100%果糖在初始pH為12.8時(shí)5-HMF含量最高，可超過(guò)0.05 g/L。3種有機(jī)酸的合成量均隨果糖比例的增加而增加。這是由于葡萄糖降解較為困難，且需要金屬離子作為催化劑，甲酸、乙酸和5-HMF主要為果糖降解產(chǎn)物。果糖的主要降解產(chǎn)物是5-HMF，但5-HMF并不穩(wěn)定，在一定條件下也會(huì)發(fā)生低聚或進(jìn)一步降解成乙酰丙酸和甲酸。乙酰丙酸也不穩(wěn)定，容易生成γ-內(nèi)酯[6]。因此反應(yīng)體系中檢測(cè)到的5-HMF含量較低，且無(wú)乙酰丙酸檢出。

果糖和葡萄糖在高pH條件下溶液顏色會(huì)發(fā)生一定變化，圖5為3種不同果糖含量的反應(yīng)底物在不同pH條件下顏色變化曲線。使用分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)體系的A420nm，可以發(fā)現(xiàn)3種果糖含量的反應(yīng)底物的顏色變化非常接近，有色物質(zhì)在pH大于11時(shí)才開(kāi)始合成，隨著pH的增加反應(yīng)體系顏色明顯加深。

圖5 不同pH值下反應(yīng)23 h對(duì)體系顏色變化的影響Fig.5 Effect of different alkali pH values on color change of the system after 23 hours

3 結(jié)語(yǔ)

作者對(duì)果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中甘露糖產(chǎn)生的原因進(jìn)行研究，證實(shí)了葡萄糖異構(gòu)酶和堿性環(huán)境均可能導(dǎo)致甘露糖產(chǎn)生。使用兩種不同的商品化異構(gòu)酶發(fā)現(xiàn)異構(gòu)過(guò)程都會(huì)產(chǎn)生甘露糖；并通過(guò)比較客戶(hù)異構(gòu)進(jìn)料樣和純葡萄糖漿兩種底物，發(fā)現(xiàn)高純度底物有助于降低甘露糖產(chǎn)生，另外糖漿與異構(gòu)酶接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也是甘露糖產(chǎn)生的一個(gè)重要原因。在研究不同堿性pH環(huán)境對(duì)果糖和果糖葡萄糖混合物影響時(shí)發(fā)現(xiàn)將pH降至10以下可有效降低甘露糖產(chǎn)生并且較高的果糖比例也會(huì)提高甘露糖的合成。除甘露糖外，在堿性pH環(huán)境中果糖和果糖葡萄糖混合物還會(huì)產(chǎn)生少量甲酸、乙酸、5-HMF等有機(jī)酸雜質(zhì)和一些有色物質(zhì)。

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