• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高富硒酵母菌誘變選育研究

    2013-11-09 00:45:16曾禮華馬平美黃崇波陳貴英葛方蘭鄺聲耀
    食品與生物技術(shù)學報 2013年10期
    關鍵詞:氨酸酵母菌抗性

    曾禮華, 馬平美, 李 維*, 黃崇波, 張 純,陳貴英, 葛方蘭, 唐 凌, 鄺聲耀

    (1.四川師范大學 生命科學學院,四川 成都610061;2.四川省畜科飼料有限公司,四川 成都610066)

    世界衛(wèi)生組織于1973年將硒確定為人和動物必需的微量元素,同年美國FDA批準亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應用于動物養(yǎng)殖業(yè)。近年來,越來越多的研究揭示和驗證了硒的多種生理功能,主要包括:抗氧化作用[1-2],增強免疫作用與抗病作用[3-5],調(diào)節(jié)機體代謝[2],另外,硒還能增強人和動物的生殖機能[6-7],具有抗自由基,延緩衰老,拮抗有毒元素等作用[7]。

    由于硒元素具有上述重要的生理功能,其作為機體必需的營養(yǎng)元素早就引起人們的高度重視[8-9]。目前,硒營養(yǎng)強化劑主要有3種即無機態(tài)亞硒酸鈉、有機態(tài)硒及富硒酵母,無機硒和有機硒化合物都能被動物機體吸收,但是,由于畜禽對無機硒吸收利用過程中,無機硒須先進入肝臟,轉(zhuǎn)化成生物硒后才可被吸收,因而毒性很大,而富硒酵母具有吸收性好、安全無毒等優(yōu)點,是一種比較理想的硒營養(yǎng)劑[9],已被用作營養(yǎng)強化劑應用到各種食品中,在預防和治療疾病以及養(yǎng)殖業(yè)等方面也有廣泛的應用[8-9]。我國20個省市中,缺硒、貧硒縣高達72%,全國近7億人口處于缺硒狀態(tài),因此開發(fā)高富硒酵母具有重要的意義。

    酵母硒是通過酵母自身的代謝活動,將無機硒在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為與蛋白質(zhì)和多糖相結(jié)合的有機硒,提高了硒的利用率和安全性[10]。已有的研究結(jié)果表明,在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[9-10]。硒是硫的類似物,硒被生物同化吸收是利用S的代謝酶作用進入細胞,取代S整合到游離氨基酸和蛋白質(zhì)中[9-10],因而,無機硒鹽離子和無機硫酸酸根離子在吸收同化過程中競爭同一轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

    國內(nèi)已有多篇有關富硒酵母菌選育的報道[11-13],但多采用單一誘變劑處理的方法,難以獲得理想的富硒酵母突變菌株。作者利用多種來源的酵母菌,先通過亞硒酸抗性篩選,選出硒耐受性和富硒能力強的酵母菌株,并以此為出發(fā)菌株,經(jīng)亞硝基胍(NTG)、紫外線復合誘變,再分別結(jié)合亞硒酸抗性、乙硫氨酸抗性篩選,選育出高產(chǎn)富硒酵母菌株,旨在為酵母硒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 菌種來源

    由市農(nóng)產(chǎn)品市場購買到的8種食用酵母粉和3種酒曲,作為菌株分離的樣品來源。另外,從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買到10株食品安全級的酵母菌直接作為供試菌株,包括:2株熱帶假絲酵 母 (Candida tropicalis),2 株 釀 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae),2 株 產(chǎn) 朊 假 絲 酵 母(Candida utilis), 其余葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、白球擬 酵 母 (Torulopsis candida)、 粟 酒 裂 殖 酵 母(Schizosaccharomyces pombe)各 1 株。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 YEPD和YNB培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制參照文獻[14-15]的方法,加1.8%的瓊脂即成固體培養(yǎng)基;

    1.2.2 酵母菌分離培養(yǎng)基 (孟加拉紅培養(yǎng)基)配方 (g/L):蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,磷酸二氫鉀(K2HPO4·3H2O)1 g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g,瓊脂 15~20 g,蒸餾水 1 000 mL,氯霉素 0.1 g;上述各成分加入蒸餾水中溶解后,再加孟加拉紅溶液(1%水溶液)3.3 mL。另用少量乙醇溶解氯霉素,加入培養(yǎng)基中,分裝后,121℃滅菌20 min;

    1.2.3 亞硒酸鈉抗性篩選培養(yǎng)基 在YEPD培養(yǎng)基中加入一定濃度過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液;

    1.2.4 乙硫氨酸抗性培養(yǎng)基 在YNB培養(yǎng)集中加入一定量過濾滅菌的乙硫氨酸溶液。

    1.3 試劑

    3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB):Fluka 公司產(chǎn)品;亞硝基胍、DL-乙硫氨酸、硒代蛋氨酸標準品:Sigma公司產(chǎn)品。

    1.4 菌種初篩

    分別稱取食用酵母粉和酒曲樣品各2 g,加入到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中,30℃,靜置活化2 h,梯度稀釋,取0.2 mL稀釋涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上,30℃,培養(yǎng)24 h,挑取單菌落于斜面保存。

    1.5 亞硒酸鈉抗性復篩

    亞硒酸鈉溶液過濾除菌后,加入到滅菌的培養(yǎng)基中, 制備 Se4+含量分別為 0、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基。將分離獲得的酵母菌株及購買的10株菌活化后,制作菌懸液,分別取0.2 mL菌懸液,涂布于上述固體亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng),48 h后觀察。選出菌落較大,顏色較淺的酵母菌于斜面培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。從新鮮斜面上轉(zhuǎn)接于一環(huán)菌體于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),測其生物量和硒含量,篩選出生物量和硒含量較高的酵母菌株。

    1.6 酵母中硒含量的測定

    參照文獻[14-16],采用 3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法測定酵母細胞的總硒含量及無機硒含量,兩者之差即為酵母細胞內(nèi)有機硒的含量。

    1.7 菌體生物量的測定

    取發(fā)酵菌液于4 000 r/min離心10 min,收集菌體,無菌水洗滌3次,65℃烘干至恒重后,稱量即得菌體生物量(g/L)。

    1.8 氨基酸成分分析

    樣品的氨基酸成分委托中國測試技術(shù)研究院測定。

    1.9 菌種的誘變與篩選

    1.9.1 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液,4 000 r/min離心,用生理鹽水洗滌數(shù)次,懸浮于檸檬酸緩沖液,細胞濃度調(diào)至107個/mL,加入0.5 mL亞硝基胍溶液,35℃振蕩處理1 h,其致死率為80%。加入生理鹽水稀釋終止反應,再用生理鹽水洗滌數(shù)次,懸浮于生理鹽水中。取適量上述菌液涂布于Se4+含量為80 μg/mL的亞硒酸鈉抗性平板中,避光培養(yǎng)48 h。

    1.9.2 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液稀釋,涂布于乙硫氨酸質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/L 的 YNB 培養(yǎng)基上(每一個濃度梯度設2個平行實驗組),經(jīng)48~72 h培養(yǎng)后,確定菌株的乙硫氨酸敏感性。

    將前述誘變獲得的高產(chǎn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期,收集細胞,用無菌水稀釋成107個/mL。吸取6 mL菌懸液于直徑為9 cm的無菌平板中,將平皿置于紫外誘變箱中,使無菌平板距離紫外燈管25 cm左右,經(jīng)紫外燈照射60 s,致死率為80%。將經(jīng)上述紫外線誘變處理后的菌液適當稀釋,涂布于乙硫氨酸抗性平板上,避光培養(yǎng)48 h。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 亞硒酸鈉抗性菌株篩選

    從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離獲得26株菌株,加上作者所在實驗室購買并保存的10株酵母菌,共計36株。對該36株酵母菌進行亞硒酸鈉抗性篩選,獲得3株能在Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的平板上生長的菌株。研究表明,在Se4+質(zhì)量濃度低于20 μg/mL的平板上,各個菌株與對照組相比,生長狀況無明顯差異。Se4+質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時,有的菌株生長開始受阻;當Se4+質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時,有14株能正常生長;當Se4+質(zhì)量濃度達到80 μg/mL時,不同酵母菌株生長差異十分明顯,36株供試菌中僅有3株能正常生長,它們分別是釀酒酵母A1-2,熱帶假絲酵母1254,產(chǎn)朊假絲酵母Y-3,當 Se4+質(zhì)量濃度高達 100 μg/mL時,所有菌株均不能正常生長。對該3株菌株分別進行復篩,測定其生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率,結(jié)果見表1。

    表1 亞硒酸鈉抗性菌株的篩選Table 1 Screening of sodium selenite-resistant strains

    由表 可見,熱帶假絲酵母菌株 的生物量、有機硒含量及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高,分別為4.1 g/L、521.99 μg/g、73.26%。故選擇熱帶假絲酵母菌株1254作為誘變育種的出發(fā)菌株。

    2.2 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性株的篩選

    出發(fā)菌株熱帶假絲酵母菌1254經(jīng)亞硝基胍誘變后,涂布亞硒酸鈉抗性平板篩選,以菌落大小和顏色特征為指標,挑出菌落較大顏色較淺的株菌,依次編號。將各菌株接種在 Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒的質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。共計挑出12株菌落較大、顏色較淺的菌株,進行發(fā)酵培養(yǎng),獲得總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高的菌株1254-6,與出發(fā)菌株對比如表2。

    表2 出發(fā)菌株1254和化學誘變株1254-6的生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 2 Biomass and selenium content of the parental strain 1254 and mutant 1254-6

    由表2可見,與出發(fā)菌株1254相比,誘變菌株1254-6的生物量降低了13.17%,但誘變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍,故選取菌株1254-6作為下一輪誘變育種的材料。

    2.3 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性菌株篩選結(jié)果

    2.3.1 乙硫氨酸抗性分析 將菌株1254-6活化后稀釋,涂布于一定乙硫氨酸濃度梯度的YNB培養(yǎng)基上,經(jīng)48~72 h培養(yǎng)后,觀察其生長情況。結(jié)果顯示,與大多數(shù)酵母菌相似,該菌株在乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L的平板上,不能正常生長。因此選擇乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L作為誘變抗性的篩選質(zhì)量濃度。

    2.3.2 乙硫氨酸抗性株的篩選 1254-6菌株經(jīng)紫外誘變處理,菌懸液稀釋涂布于含1.0 g/L乙硫氨酸的YNB平板上,避光培養(yǎng)72 h。挑選生長快,菌落較大,顏色較淺的抗性菌株共37株,編號為1254-6-1到1254-6-37。將其點樣于含乙硫氨酸的平板上,培養(yǎng)48~72 h,每組設3個平行實驗組。根據(jù)菌落大小及生長情況選取16株菌株,在發(fā)酵培養(yǎng)集中進行富硒培養(yǎng),測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。其中菌株1254-6-1含硒量最高的,結(jié)果如表3所示。

    表3 菌株1254-6-1生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 3 Biomass and selenium content of mutant 1254-6-1

    由表3可見,與菌株1254-6相比,菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別提高了2.13倍、1.20倍、1.21倍、1.01倍。與原始出發(fā)菌株1254相比,雙抗菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別提高1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍,分別達到 7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。

    出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理,顯著提高了菌株總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率,但降低了菌株生物量。出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理后,再采用紫外線誘變處理,結(jié)果獲得的菌株生物量得以明顯提高,總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率也得以改善。由此可見,采用不同誘變劑處理,可以減少單一誘變劑的負突變,實現(xiàn)正突變的累加,從而提高育種效率。

    2.4 突變菌株氨基酸含量分析

    利用氨基酸自動分析儀對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的質(zhì)量分數(shù)進行測定,結(jié)果見表4。

    表4 誘變株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸質(zhì)量分數(shù)Table 4 Content of amino acids of mutant 1254-6-1 and the parental strain 1254

    由表4可知,經(jīng)過連續(xù)誘變及兩種抗性平板的反復篩選得到的菌株1254-6-1,各種氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)均高于出發(fā)菌株,其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%,胱氨酸是194.1%,從代謝途徑來可知,胱氨酸為蛋氨酸的合成提供巰基,說明合成前體物含量的增加可造成蛋氨酸的增加。有前人研究結(jié)果可知,在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[8-9],因此由此推測,半胱氨酸和蛋氨酸含量的變化與酵母體內(nèi)硒含量是呈正相關性的。此外,與出發(fā)菌株相比,誘變后菌株中酪氨酸的含量也有較大提高,是出發(fā)菌株的140%。酪氨酸用途很廣泛,在醫(yī)藥上用作甲狀腺功能亢進,也可作為食品添加劑。另外酪氨酸還是一種重要的生化試劑,是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。廣泛用于農(nóng)業(yè)科學研究,也作飼料添加劑和配制人工昆蟲飼料。

    3 結(jié)語

    從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離得到26株酵母菌菌株,連同由中國微生物菌種保藏中心提供的10株酵母菌,共36株菌。通過對該36株酵母菌進行硒耐受性初篩和搖瓶發(fā)酵富硒復篩,獲得1株硒耐受性高且富硒能力較強的熱帶假絲酵母菌株1254。對菌株1254進行了多輪誘變選育。通過亞硝基胍誘變,亞硒酸鈉抗性篩選后,獲得了12株抗性菌,其中突變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍。突變菌株1254-6經(jīng)紫外誘變和乙硫氨酸抗性篩選后,獲得了乙硫氨酸抗性菌株37株,其中突變菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別達到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。 對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)分別進行測定,結(jié)果顯示,雙抗性株1254-6-1的各種氨基酸含量均高于出發(fā)菌株1254,其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%,胱氨酸是194.1%。

    [1]WANG Z G,PAN X J,ZHANG W Q,et al.Methionine and selenium yeast supplementation of the maternal diets affects antioxidant activity of breeding eggs[J].Poultry Science,2010,89(5):931-937.

    [2]Margaret P R.The importance of selenium to human health[J].The Lancet,2000,356:233-241.

    [3]QIN Shun-yi,HUANG Ke-he,GAO Jian-zhong,et al.Comparison of glutathione peroxidase and iodothyronine deiodinase mRNA expression in murine fiver after feeding selenite or selenized yeast[J].Journal of Trace Elements in Medicine and Biology,2009,23(1):29-35.

    [4]張國蓉,王燕,劉安軍.富硒酵母對CCl4肝損傷小鼠免疫功能的影響[J].食品科技,2009,34(3):118-125.ZHANG Guo-Rong,WANG Yan,LIU An-Jun.Effect of selenium-enriched yeast on the antioxidant function in liver injury mice[J].Food Science and Technology,2009,25(2):118-120.(in Chinese)

    [5]胡濱,陳一資,辜雪冬.硒強化劑的急性和蓄積毒性試驗研究[J].食品與生物技術(shù)學報,2010,29(4):553-557.HU Bin,CHEN Yi-zi,GU Xue-dong.Experiment on acute and accumulative toxicity test of Selenium reinforcement[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2010,29(4):553-557.(in Chinese)

    [6]王玨,黃亞軍,梁林,等.中藥富硒酵母對動物中樞免疫器官發(fā)育的影響[J].微量元素與健康研究,2009,26(2):8-11.WANG Jue,HUANG Ya-jun,LIANG Lin,et al.Effect of Se-enriched yeast cultured in Chinese medicine on development of central immune organ in animal[J].Studies of Trace Elements and Health,2009,26(2):8-11.(in Chinese)

    [7]Fortier ME,Audet I,Giguère A,et al.Effect of dietary organic and inorganic selenium on antioxidant status,embryo development,and reproductive performance in hyperovulatory first-parity gilts[J].Journal of Animal Science,2012,90(1):231-40.

    [8]Rotruck J T,Pope A L,Ganther H E,et al.Selenium:Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J].Science,1973,179(74):588-590.

    [9]李淑敏.酵母作為微量元素載體的研究及應用前景[J].微生物學通報,1999,26(3):220-223.LI Shu-ming.The research progress and application prospect of yeast enriching trace elements[J].Microbiology,1999,26(3):220-223.(in Chinese)

    [10]Poncede Leon C A,Bayón M M,Paquin C,et al.Selenium incorporation into Saccharomyces cerevisiae cells:a study of different incorporation methods[J].Journal of Applied Microbiology,2002,92:602-610.(in Chinese)

    [11]王小波,柳樂,李學如.高富硒酵母菌種選育研究[J].食品與發(fā)酵科技,47(5):6-9.WANG Xiao-bo,LIU Le,LI Xue-ru.Breeding of a high selenium-enriched yeast strain[J].Food and Fermentation Technology,47(5):6-9.(in Chinese)

    [12]范秀英,郭雪娜,傅秀輝,等.高生物量富硒酵母的選育及培養(yǎng)條件初步優(yōu)化[J].生物工程學報,2003,19(6):720-724.FAN Xiu-ying,GUO Xue-na,F(xiàn)U Xiu-hui,et al.The breeding and culture condition optimization of a high-biomass,seleniumenriched yeast strain[J].Chinese Journal of Biotechnology,2003,19(6):720-724.(in Chinese)

    [13]張順濤,李肖,左濤,等.高生物量富硒酵母菌的選育[J].中國釀造,2008,21:37-40.ZHANG Shun-tao,LI Xiao,ZUO Tao,et al.Breeding of a high-biomass and selenium-enriched yeast strain[J].China Brewing,2008,21:37-40.(in Chinese)

    [14]賀立東.分光光度法測定富硒酵母中有機硒的含量[J].食品工業(yè)科技,2000,21(5):67-68.HE Li-dong.Spectrometry for determination of organo-Selenium in Selenium-enriched yeast[J].Science and Technology of Food Industry,2000,21(5):67-68.(in Chinese)

    [15]劉曲濱,劉康,包惠燕,等.富硒酵母中硒含量的測定[J].廣州食品工業(yè)科技,1999,63(16):33-35.LIU Qu-bin,LIU Kang,BAO Hui-yan,et al.Determination of selenium in selenium enriched yeast[J].Guangzhou Food Science and Technology,1999,63(16):33-35.(in Chinese)

    [16]王黎,周之榮,羅明標.溴酸鉀氧化二甲基黃動力學光度法測定食品中的痕量硒(Ⅳ)[J].食品與生物技術(shù)學報,2006,25(1):31-34.WANG Li,ZHOU Zhi-rong,LUO Ming-biao.Kinetic spectrophotometric determination of trace selenium ( Ⅳ )based on discoloring of dimethyl yellow oxidized by potassium bromate[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2006,25(1):31-34.(in Chinese)

    猜你喜歡
    氨酸酵母菌抗性
    蒜氨酸抗菌機制研究
    一個控制超強電離輻射抗性開關基因的研究進展
    為什么酵母菌既能做面包也能釀酒?
    甲基對硫磷抗性菌的篩選及特性研究
    高羊毛氨酸硒提高豬肌肉中硒沉積
    廣東飼料(2016年7期)2016-12-01 03:43:36
    甜玉米常見病害的抗性鑒定及防治
    中國果菜(2016年9期)2016-03-01 01:28:44
    用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標記
    中國蔬菜(2015年9期)2015-12-21 13:04:40
    讓面包變“胖”的酵母菌
    蒜氨酸的分離純化研究進展
    蜂蜜中耐高滲透壓酵母菌的分離與鑒定
    国产在线视频一区二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 999久久久精品免费观看国产| 又大又爽又粗| 亚洲精品一区蜜桃| 色老头精品视频在线观看| 伦理电影免费视频| 90打野战视频偷拍视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产成人免费| 黄片小视频在线播放| 动漫黄色视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲一区二区精品| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99国产精品一区二区三区| 国产在线观看jvid| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲av美国av| 免费无遮挡裸体视频| 久久久精品大字幕| 亚洲人成伊人成综合网2020| cao死你这个sao货| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品久久久久久久久久免费视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲电影在线观看av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 天天添夜夜摸| 悠悠久久av| 精品一区二区三区av网在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成年人精品一区二区| 在线视频色国产色| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品在线观看二区| 全区人妻精品视频| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美黑人精品巨大| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久久久国产一级毛片高清牌| www.熟女人妻精品国产| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人精品无人区| 国产成年人精品一区二区| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩精品网址| 91在线观看av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一进一出抽搐动态| 午夜免费激情av| 亚洲人成77777在线视频| 变态另类丝袜制服| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 一区二区三区激情视频| 成人国产综合亚洲| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲av成人一区二区三| 精品国产乱子伦一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产一区二区在线av高清观看| 男人舔奶头视频| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美成人午夜精品| 91九色精品人成在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美另类亚洲清纯唯美| bbb黄色大片| 日韩av在线大香蕉| 久久久久久久午夜电影| 亚洲18禁久久av| 国产野战对白在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 一本大道久久a久久精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久99久视频精品免费| 欧美色视频一区免费| 制服诱惑二区| 免费看十八禁软件| 久久精品91无色码中文字幕| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日本五十路高清| 日韩欧美精品v在线| 国产精品,欧美在线| 在线永久观看黄色视频| 国产精品av久久久久免费| 久久九九热精品免费| 校园春色视频在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品久久视频播放| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产激情欧美一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 国产精品 欧美亚洲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 女警被强在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 美女 人体艺术 gogo| 麻豆av在线久日| 国产私拍福利视频在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜精品在线福利| 亚洲人成77777在线视频| 国产主播在线观看一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久香蕉精品热| 黄色成人免费大全| 国产99白浆流出| 国产午夜福利久久久久久| 久久香蕉精品热| 午夜两性在线视频| 欧美性长视频在线观看| 午夜激情av网站| 全区人妻精品视频| 亚洲成人久久性| 嫩草影视91久久| 国产一区二区三区视频了| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产一区二区三区视频了| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产午夜福利久久久久久| 国产一区二区三区视频了| 精品人妻1区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 啦啦啦免费观看视频1| 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品久久久久久精品电影| 草草在线视频免费看| 99久久精品热视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品中文字幕在线视频| av中文乱码字幕在线| 欧美在线黄色| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲电影在线观看av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜福利18| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美午夜高清在线| 性色av乱码一区二区三区2| 可以在线观看的亚洲视频| www.精华液| 亚洲成av人片在线播放无| 国产黄片美女视频| 久久人人精品亚洲av| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品久久久久久久久久免费视频| 一级a爱片免费观看的视频| 日韩高清综合在线| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 18禁国产床啪视频网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 小说图片视频综合网站| 91av网站免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| svipshipincom国产片| 悠悠久久av| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品成人免费网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 黄色视频不卡| 中文在线观看免费www的网站 | 色av中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产视频一区二区在线看| 久久精品影院6| 成人国语在线视频| 18禁观看日本| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产一区二区在线观看日韩 | 黄色视频不卡| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品影院久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品一区二区在线观看| videosex国产| 级片在线观看| 美女大奶头视频| tocl精华| 国产激情欧美一区二区| 波多野结衣高清无吗| 欧美黑人欧美精品刺激| 99久久无色码亚洲精品果冻| 首页视频小说图片口味搜索| 一本综合久久免费| 村上凉子中文字幕在线| 五月玫瑰六月丁香| www.www免费av| 少妇的丰满在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲 国产 在线| 九色成人免费人妻av| 久9热在线精品视频| 久久 成人 亚洲| 男人舔女人的私密视频| 男女视频在线观看网站免费 | 午夜亚洲福利在线播放| 91老司机精品| 国产主播在线观看一区二区| 精品久久蜜臀av无| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲一码二码三码区别大吗| netflix在线观看网站| 丰满的人妻完整版| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久 成人 亚洲| 老熟妇仑乱视频hdxx| 波多野结衣高清作品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 色哟哟哟哟哟哟| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产麻豆成人av免费视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 深夜精品福利| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲真实伦在线观看| 国产成人影院久久av| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产一区在线观看成人免费| 久久中文看片网| 日本免费a在线| 很黄的视频免费| 国产熟女xx| 国产精品久久久av美女十八| 欧美成人性av电影在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 两个人看的免费小视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品美女久久av网站| 一级作爱视频免费观看| 久久人妻av系列| 午夜福利高清视频| 91国产中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产免费男女视频| 九九热线精品视视频播放| 成人国语在线视频| 男女午夜视频在线观看| 99久久国产精品久久久| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国内精品一区二区在线观看| 黄频高清免费视频| 天堂影院成人在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 成年版毛片免费区| 精品国产美女av久久久久小说| x7x7x7水蜜桃| 999精品在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美精品v在线| 国产精品久久视频播放| 久久午夜亚洲精品久久| 国产成人aa在线观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 男女视频在线观看网站免费 | 亚洲片人在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲第一电影网av| 在线永久观看黄色视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成人三级黄色视频| 成年免费大片在线观看| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老司机午夜十八禁免费视频| 一本综合久久免费| av在线播放免费不卡| 国产成人aa在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲在线自拍视频| www.自偷自拍.com| 成在线人永久免费视频| 成人一区二区视频在线观看| 国产视频一区二区在线看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人三级做爰电影| 999久久久精品免费观看国产| 90打野战视频偷拍视频| 国产高清videossex| 国产午夜福利久久久久久| av有码第一页| 亚洲精品国产一区二区精华液| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲中文av在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看66精品国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 香蕉丝袜av| 久久性视频一级片| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看一区二区三区| 成人手机av| 中文资源天堂在线| 久久久久亚洲av毛片大全| 美女大奶头视频| www日本在线高清视频| 波多野结衣高清无吗| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文字幕av在线有码专区| 日本 av在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99国产精品一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成年人黄色毛片网站| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品色激情综合| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 此物有八面人人有两片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 韩国av一区二区三区四区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲五月婷婷丁香| 99国产精品99久久久久| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一级作爱视频免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 热99re8久久精品国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久香蕉激情| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品 国内视频| av免费在线观看网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品国产高清国产av| 国产黄色小视频在线观看| 国产免费男女视频| 人成视频在线观看免费观看| 麻豆成人av在线观看| 麻豆av在线久日| 麻豆成人av在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 曰老女人黄片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久性视频一级片| 日韩免费av在线播放| bbb黄色大片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产69精品久久久久777片 | 美女黄网站色视频| 免费在线观看日本一区| 日韩三级视频一区二区三区| 一级毛片高清免费大全| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 又黄又粗又硬又大视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av成人av| 中出人妻视频一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩欧美 国产精品| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产单亲对白刺激| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久99热这里只有精品18| 级片在线观看| 变态另类丝袜制服| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品永久免费网站| 亚洲,欧美精品.| 免费在线观看日本一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 757午夜福利合集在线观看| 欧美黑人巨大hd| 久久国产精品影院| 在线观看午夜福利视频| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久人人精品亚洲av| 成熟少妇高潮喷水视频| 美女黄网站色视频| 国产1区2区3区精品| av在线天堂中文字幕| 搞女人的毛片| 在线观看午夜福利视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产一区二区在线观看日韩 | 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲最大成人中文| 九九热线精品视视频播放| 久久久精品大字幕| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成人av在线播放网站| 在线观看免费视频日本深夜| 久久久久九九精品影院| 12—13女人毛片做爰片一| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久中文字幕人妻熟女| 精品久久久久久久久久久久久| 免费看a级黄色片| aaaaa片日本免费| 精品久久久久久,| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄片小视频在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久99久视频精品免费| 18禁观看日本| 99久久综合精品五月天人人| 精品国产美女av久久久久小说| 高潮久久久久久久久久久不卡| 91成年电影在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜激情福利司机影院| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成人国产一区在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| 黄频高清免费视频| 全区人妻精品视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲片人在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲人成77777在线视频| 757午夜福利合集在线观看| 十八禁人妻一区二区| 18禁观看日本| 色av中文字幕| 免费高清视频大片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 麻豆av在线久日| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 1024香蕉在线观看| 麻豆一二三区av精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 搡老熟女国产l中国老女人| 成人午夜高清在线视频| 欧美日韩黄片免| av片东京热男人的天堂| 国产精品av视频在线免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 成在线人永久免费视频| 久久国产精品影院| 热99re8久久精品国产| 日韩精品青青久久久久久| 很黄的视频免费| 亚洲全国av大片| 欧美日韩一级在线毛片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久视频播放| av免费在线观看网站| 国产精品 国内视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精华国产精华精| av免费在线观看网站| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲欧美精品综合久久99| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美午夜高清在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产av麻豆久久久久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 可以在线观看毛片的网站| 18禁美女被吸乳视频| 精品国产亚洲在线| aaaaa片日本免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 波多野结衣巨乳人妻| av视频在线观看入口| 精品国产亚洲在线| 国产成人欧美在线观看| 国产精品,欧美在线| 韩国av一区二区三区四区| 麻豆av在线久日| 男人舔奶头视频| 久久伊人香网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人aa在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美大码av| 听说在线观看完整版免费高清| 在线观看66精品国产| 一本一本综合久久| 嫩草影视91久久| 日本在线视频免费播放| 91成年电影在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美午夜高清在线| 91老司机精品| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 成人国语在线视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产高清videossex| 亚洲精品色激情综合| 亚洲 欧美一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美 | 色在线成人网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久99热这里只有精品18| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲av成人av| 欧美高清成人免费视频www| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 99久久精品热视频| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品九九99| 国产乱人伦免费视频| 国内精品久久久久久久电影| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久国产成人免费| av在线播放免费不卡| 人人妻人人看人人澡| 俺也久久电影网| 丁香欧美五月| 国产激情偷乱视频一区二区| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人系列免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 1024视频免费在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 91老司机精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲 国产 在线| 午夜福利成人在线免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 三级毛片av免费| 亚洲,欧美精品.| 日韩精品中文字幕看吧| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品,欧美在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久中文看片网| 日韩精品中文字幕看吧| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲18禁久久av| 亚洲一区中文字幕在线| 99久久国产精品久久久| 日韩欧美三级三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久国产精品麻豆| 一区二区三区激情视频| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲中文av在线| 一区二区三区激情视频| 亚洲avbb在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩欧美 国产精品| 午夜久久久久精精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品一区二区免费欧美| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av|