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    高富硒酵母菌誘變選育研究

    2013-11-09 00:45:16曾禮華馬平美黃崇波陳貴英葛方蘭鄺聲耀
    食品與生物技術(shù)學報 2013年10期
    關鍵詞:氨酸酵母菌抗性

    曾禮華, 馬平美, 李 維*, 黃崇波, 張 純,陳貴英, 葛方蘭, 唐 凌, 鄺聲耀

    (1.四川師范大學 生命科學學院,四川 成都610061;2.四川省畜科飼料有限公司,四川 成都610066)

    世界衛(wèi)生組織于1973年將硒確定為人和動物必需的微量元素,同年美國FDA批準亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應用于動物養(yǎng)殖業(yè)。近年來,越來越多的研究揭示和驗證了硒的多種生理功能,主要包括:抗氧化作用[1-2],增強免疫作用與抗病作用[3-5],調(diào)節(jié)機體代謝[2],另外,硒還能增強人和動物的生殖機能[6-7],具有抗自由基,延緩衰老,拮抗有毒元素等作用[7]。

    由于硒元素具有上述重要的生理功能,其作為機體必需的營養(yǎng)元素早就引起人們的高度重視[8-9]。目前,硒營養(yǎng)強化劑主要有3種即無機態(tài)亞硒酸鈉、有機態(tài)硒及富硒酵母,無機硒和有機硒化合物都能被動物機體吸收,但是,由于畜禽對無機硒吸收利用過程中,無機硒須先進入肝臟,轉(zhuǎn)化成生物硒后才可被吸收,因而毒性很大,而富硒酵母具有吸收性好、安全無毒等優(yōu)點,是一種比較理想的硒營養(yǎng)劑[9],已被用作營養(yǎng)強化劑應用到各種食品中,在預防和治療疾病以及養(yǎng)殖業(yè)等方面也有廣泛的應用[8-9]。我國20個省市中,缺硒、貧硒縣高達72%,全國近7億人口處于缺硒狀態(tài),因此開發(fā)高富硒酵母具有重要的意義。

    酵母硒是通過酵母自身的代謝活動,將無機硒在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為與蛋白質(zhì)和多糖相結(jié)合的有機硒,提高了硒的利用率和安全性[10]。已有的研究結(jié)果表明,在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[9-10]。硒是硫的類似物,硒被生物同化吸收是利用S的代謝酶作用進入細胞,取代S整合到游離氨基酸和蛋白質(zhì)中[9-10],因而,無機硒鹽離子和無機硫酸酸根離子在吸收同化過程中競爭同一轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。

    國內(nèi)已有多篇有關富硒酵母菌選育的報道[11-13],但多采用單一誘變劑處理的方法,難以獲得理想的富硒酵母突變菌株。作者利用多種來源的酵母菌,先通過亞硒酸抗性篩選,選出硒耐受性和富硒能力強的酵母菌株,并以此為出發(fā)菌株,經(jīng)亞硝基胍(NTG)、紫外線復合誘變,再分別結(jié)合亞硒酸抗性、乙硫氨酸抗性篩選,選育出高產(chǎn)富硒酵母菌株,旨在為酵母硒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 菌種來源

    由市農(nóng)產(chǎn)品市場購買到的8種食用酵母粉和3種酒曲,作為菌株分離的樣品來源。另外,從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購買到10株食品安全級的酵母菌直接作為供試菌株,包括:2株熱帶假絲酵 母 (Candida tropicalis),2 株 釀 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae),2 株 產(chǎn) 朊 假 絲 酵 母(Candida utilis), 其余葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、異常漢遜酵母(Hansenula anomala)、白球擬 酵 母 (Torulopsis candida)、 粟 酒 裂 殖 酵 母(Schizosaccharomyces pombe)各 1 株。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 YEPD和YNB培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制參照文獻[14-15]的方法,加1.8%的瓊脂即成固體培養(yǎng)基;

    1.2.2 酵母菌分離培養(yǎng)基 (孟加拉紅培養(yǎng)基)配方 (g/L):蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,磷酸二氫鉀(K2HPO4·3H2O)1 g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g,瓊脂 15~20 g,蒸餾水 1 000 mL,氯霉素 0.1 g;上述各成分加入蒸餾水中溶解后,再加孟加拉紅溶液(1%水溶液)3.3 mL。另用少量乙醇溶解氯霉素,加入培養(yǎng)基中,分裝后,121℃滅菌20 min;

    1.2.3 亞硒酸鈉抗性篩選培養(yǎng)基 在YEPD培養(yǎng)基中加入一定濃度過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液;

    1.2.4 乙硫氨酸抗性培養(yǎng)基 在YNB培養(yǎng)集中加入一定量過濾滅菌的乙硫氨酸溶液。

    1.3 試劑

    3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB):Fluka 公司產(chǎn)品;亞硝基胍、DL-乙硫氨酸、硒代蛋氨酸標準品:Sigma公司產(chǎn)品。

    1.4 菌種初篩

    分別稱取食用酵母粉和酒曲樣品各2 g,加入到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中,30℃,靜置活化2 h,梯度稀釋,取0.2 mL稀釋涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上,30℃,培養(yǎng)24 h,挑取單菌落于斜面保存。

    1.5 亞硒酸鈉抗性復篩

    亞硒酸鈉溶液過濾除菌后,加入到滅菌的培養(yǎng)基中, 制備 Se4+含量分別為 0、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基。將分離獲得的酵母菌株及購買的10株菌活化后,制作菌懸液,分別取0.2 mL菌懸液,涂布于上述固體亞硒酸鈉抗性培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng),48 h后觀察。選出菌落較大,顏色較淺的酵母菌于斜面培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。從新鮮斜面上轉(zhuǎn)接于一環(huán)菌體于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng),測其生物量和硒含量,篩選出生物量和硒含量較高的酵母菌株。

    1.6 酵母中硒含量的測定

    參照文獻[14-16],采用 3,3’-二氨基聯(lián)苯胺比色法測定酵母細胞的總硒含量及無機硒含量,兩者之差即為酵母細胞內(nèi)有機硒的含量。

    1.7 菌體生物量的測定

    取發(fā)酵菌液于4 000 r/min離心10 min,收集菌體,無菌水洗滌3次,65℃烘干至恒重后,稱量即得菌體生物量(g/L)。

    1.8 氨基酸成分分析

    樣品的氨基酸成分委托中國測試技術(shù)研究院測定。

    1.9 菌種的誘變與篩選

    1.9.1 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液,4 000 r/min離心,用生理鹽水洗滌數(shù)次,懸浮于檸檬酸緩沖液,細胞濃度調(diào)至107個/mL,加入0.5 mL亞硝基胍溶液,35℃振蕩處理1 h,其致死率為80%。加入生理鹽水稀釋終止反應,再用生理鹽水洗滌數(shù)次,懸浮于生理鹽水中。取適量上述菌液涂布于Se4+含量為80 μg/mL的亞硒酸鈉抗性平板中,避光培養(yǎng)48 h。

    1.9.2 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性篩選 取生長至對數(shù)期的酵母菌懸液稀釋,涂布于乙硫氨酸質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/L 的 YNB 培養(yǎng)基上(每一個濃度梯度設2個平行實驗組),經(jīng)48~72 h培養(yǎng)后,確定菌株的乙硫氨酸敏感性。

    將前述誘變獲得的高產(chǎn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期,收集細胞,用無菌水稀釋成107個/mL。吸取6 mL菌懸液于直徑為9 cm的無菌平板中,將平皿置于紫外誘變箱中,使無菌平板距離紫外燈管25 cm左右,經(jīng)紫外燈照射60 s,致死率為80%。將經(jīng)上述紫外線誘變處理后的菌液適當稀釋,涂布于乙硫氨酸抗性平板上,避光培養(yǎng)48 h。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 亞硒酸鈉抗性菌株篩選

    從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離獲得26株菌株,加上作者所在實驗室購買并保存的10株酵母菌,共計36株。對該36株酵母菌進行亞硒酸鈉抗性篩選,獲得3株能在Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的平板上生長的菌株。研究表明,在Se4+質(zhì)量濃度低于20 μg/mL的平板上,各個菌株與對照組相比,生長狀況無明顯差異。Se4+質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時,有的菌株生長開始受阻;當Se4+質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時,有14株能正常生長;當Se4+質(zhì)量濃度達到80 μg/mL時,不同酵母菌株生長差異十分明顯,36株供試菌中僅有3株能正常生長,它們分別是釀酒酵母A1-2,熱帶假絲酵母1254,產(chǎn)朊假絲酵母Y-3,當 Se4+質(zhì)量濃度高達 100 μg/mL時,所有菌株均不能正常生長。對該3株菌株分別進行復篩,測定其生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率,結(jié)果見表1。

    表1 亞硒酸鈉抗性菌株的篩選Table 1 Screening of sodium selenite-resistant strains

    由表 可見,熱帶假絲酵母菌株 的生物量、有機硒含量及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高,分別為4.1 g/L、521.99 μg/g、73.26%。故選擇熱帶假絲酵母菌株1254作為誘變育種的出發(fā)菌株。

    2.2 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性株的篩選

    出發(fā)菌株熱帶假絲酵母菌1254經(jīng)亞硝基胍誘變后,涂布亞硒酸鈉抗性平板篩選,以菌落大小和顏色特征為指標,挑出菌落較大顏色較淺的株菌,依次編號。將各菌株接種在 Se4+質(zhì)量濃度為80 μg/mL的液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒的質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。共計挑出12株菌落較大、顏色較淺的菌株,進行發(fā)酵培養(yǎng),獲得總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率均最高的菌株1254-6,與出發(fā)菌株對比如表2。

    表2 出發(fā)菌株1254和化學誘變株1254-6的生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 2 Biomass and selenium content of the parental strain 1254 and mutant 1254-6

    由表2可見,與出發(fā)菌株1254相比,誘變菌株1254-6的生物量降低了13.17%,但誘變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍,故選取菌株1254-6作為下一輪誘變育種的材料。

    2.3 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性菌株篩選結(jié)果

    2.3.1 乙硫氨酸抗性分析 將菌株1254-6活化后稀釋,涂布于一定乙硫氨酸濃度梯度的YNB培養(yǎng)基上,經(jīng)48~72 h培養(yǎng)后,觀察其生長情況。結(jié)果顯示,與大多數(shù)酵母菌相似,該菌株在乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L的平板上,不能正常生長。因此選擇乙硫氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L作為誘變抗性的篩選質(zhì)量濃度。

    2.3.2 乙硫氨酸抗性株的篩選 1254-6菌株經(jīng)紫外誘變處理,菌懸液稀釋涂布于含1.0 g/L乙硫氨酸的YNB平板上,避光培養(yǎng)72 h。挑選生長快,菌落較大,顏色較淺的抗性菌株共37株,編號為1254-6-1到1254-6-37。將其點樣于含乙硫氨酸的平板上,培養(yǎng)48~72 h,每組設3個平行實驗組。根據(jù)菌落大小及生長情況選取16株菌株,在發(fā)酵培養(yǎng)集中進行富硒培養(yǎng),測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質(zhì)量分數(shù),計算有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率。其中菌株1254-6-1含硒量最高的,結(jié)果如表3所示。

    表3 菌株1254-6-1生物量及硒質(zhì)量分數(shù)Table 3 Biomass and selenium content of mutant 1254-6-1

    由表3可見,與菌株1254-6相比,菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別提高了2.13倍、1.20倍、1.21倍、1.01倍。與原始出發(fā)菌株1254相比,雙抗菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別提高1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍,分別達到 7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。

    出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理,顯著提高了菌株總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率,但降低了菌株生物量。出發(fā)菌株1254經(jīng)亞硝基胍誘變處理后,再采用紫外線誘變處理,結(jié)果獲得的菌株生物量得以明顯提高,總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率也得以改善。由此可見,采用不同誘變劑處理,可以減少單一誘變劑的負突變,實現(xiàn)正突變的累加,從而提高育種效率。

    2.4 突變菌株氨基酸含量分析

    利用氨基酸自動分析儀對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的質(zhì)量分數(shù)進行測定,結(jié)果見表4。

    表4 誘變株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸質(zhì)量分數(shù)Table 4 Content of amino acids of mutant 1254-6-1 and the parental strain 1254

    由表4可知,經(jīng)過連續(xù)誘變及兩種抗性平板的反復篩選得到的菌株1254-6-1,各種氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)均高于出發(fā)菌株,其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%,胱氨酸是194.1%,從代謝途徑來可知,胱氨酸為蛋氨酸的合成提供巰基,說明合成前體物含量的增加可造成蛋氨酸的增加。有前人研究結(jié)果可知,在酵母體內(nèi)硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[8-9],因此由此推測,半胱氨酸和蛋氨酸含量的變化與酵母體內(nèi)硒含量是呈正相關性的。此外,與出發(fā)菌株相比,誘變后菌株中酪氨酸的含量也有較大提高,是出發(fā)菌株的140%。酪氨酸用途很廣泛,在醫(yī)藥上用作甲狀腺功能亢進,也可作為食品添加劑。另外酪氨酸還是一種重要的生化試劑,是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。廣泛用于農(nóng)業(yè)科學研究,也作飼料添加劑和配制人工昆蟲飼料。

    3 結(jié)語

    從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離得到26株酵母菌菌株,連同由中國微生物菌種保藏中心提供的10株酵母菌,共36株菌。通過對該36株酵母菌進行硒耐受性初篩和搖瓶發(fā)酵富硒復篩,獲得1株硒耐受性高且富硒能力較強的熱帶假絲酵母菌株1254。對菌株1254進行了多輪誘變選育。通過亞硝基胍誘變,亞硒酸鈉抗性篩選后,獲得了12株抗性菌,其中突變菌株1254-6的總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及有機硒轉(zhuǎn)化率分別是出發(fā)菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍。突變菌株1254-6經(jīng)紫外誘變和乙硫氨酸抗性篩選后,獲得了乙硫氨酸抗性菌株37株,其中突變菌株1254-6-1的生物量、總硒質(zhì)量分數(shù)、有機硒質(zhì)量分數(shù)及轉(zhuǎn)化率分別達到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。 對雙抗性株1254-6-1與出發(fā)株1254氨基酸的相對質(zhì)量分數(shù)分別進行測定,結(jié)果顯示,雙抗性株1254-6-1的各種氨基酸含量均高于出發(fā)菌株1254,其中蛋氨酸是出發(fā)株的135%,胱氨酸是194.1%。

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