NALP3富含亮氨酸重復序列結(jié)構(gòu)域識別人細胞周期蛋白H和禽冠狀病毒蛋白*

顏 亮， 羅 滔， 蔡軍偉， 畢志斐， 胡巢鳳

(1暨南大學醫(yī)學院病理生理學教研室，國家中醫(yī)藥管理局病理生理學實驗室，廣東廣州510632;2南方醫(yī)科大學病理生理學教研室，廣東廣州510515;3山西醫(yī)科大學人體解剖學教研室，山西太原030001)

固有免疫(innate immunity)是多細胞生物抗御 病原體感染和抗腫瘤的第一道防線。固有免疫細胞通過表達模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，啟動機體的生物防御機能。Toll樣受體［1］(Toll-like receptors，TLRs)是發(fā)揮固有免疫功能的關鍵PRRs，主要識別細胞外或作用于細胞表面的PAMPs，例如細菌脂多糖、肽聚糖、胞壁酸、病毒雙鏈RNA、細菌鞭毛蛋白等，其對PAMPs的識別由TLRs胞外富含亮氨酸的重復序列(leucine rich repeats，LRR)完成［2］。

然而機體在病理條件下也會出現(xiàn)PAMPs相關分子和相似的危險信號，這些PAMPs相關分子和危險信號存在于細胞內(nèi)，誘發(fā)炎癥反應和警示組織損傷。闡明機體對這些細胞內(nèi)危險信號的識別機制是一個根本性的問題。2000年Hoffman等［3-4］相繼報道了人類常染色體顯性遺傳病家族性冷誘發(fā)蕁麻疹(familial cold urticaria，F(xiàn)CU)和MW綜合征(Muckle-Wells syndrome，MWS)的致病基因是編碼NACHT，LRR and PYD domains-containing protein 3(NALP3)的CIAS1基因。CIAS1基因的突變還可引起慢性嬰幼兒神經(jīng)皮膚關節(jié)綜合癥［5］，這些疾病實質(zhì)上均為自身炎癥性病變，以炎癥復合體(inflammasome)過度激活和產(chǎn)生過量炎癥細胞因子 IL-1β為特征。NALP3又稱 cryopyrin或 PYPAF1/NLRP3，主要在白細胞中表達。NALP3的N端是重要的熱蛋白樣結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)［6］，通過接頭蛋白 ASC 與其下游的信號效應分子相聯(lián)系。中部是核苷酸偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域(domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP-1，NACHT)［7］，具有同屬蛋白寡聚化募集的功能。C端的LRR結(jié)構(gòu)域與TLR胞外段結(jié)構(gòu)相似，由多個重復結(jié)構(gòu)單位呈大致相互反向平行的 β-折疊和 α-螺旋構(gòu)成，具有分子之間相互作用和配體識別能力［8］。當細胞內(nèi)信號分子被NALP3的LRR結(jié)構(gòu)域(NALP3-LRR)識別后，引起NALP3的寡聚化和分子活化，與炎癥性凋亡蛋白酶1形成炎癥復合體，參與炎癥細胞因子 IL-1β的生成和機體固有免疫調(diào)節(jié)［9］。

NALP3能被包括ATP、細菌毒素、病原體代謝產(chǎn)物、尿酸晶體、三硝基氯苯等激活［10-12］，推測其機制與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域?qū)@些細胞內(nèi)危險信號的識別有關，而NALP3發(fā)生基因突變引起自身炎癥性病變則可能導致LRR結(jié)構(gòu)域的識別功能紊亂和NALP3過度活化。至今關于內(nèi)源性蛋白分子如何與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域相互作用甚少見報道。本研究運用酵母雙雜交技術，以人NALP3-LRR基因序列構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，對人胚肺文庫進行酵母雙雜交文庫篩選，尋找與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)分子，為進一步闡明NALP3在固有免疫調(diào)節(jié)機制中的作用提供新的資料。

材料和方法

1 材料

pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒(庫容為4×108cfu/L)和pSos質(zhì)粒(Stratagene)，cdc25H酵母細胞、酵母轉(zhuǎn)化、酵母質(zhì)粒提取所需各種試劑及YPAD、SD/glucose(－UL)、SD/galactose(－UL)培養(yǎng)平板，XL1-Blue感受態(tài)菌及分子克隆所用的常規(guī)試劑均由天津賽爾生物技術有限公司提供。

2 方法

2.1 克隆NALP3-LRR的cDNA序列及構(gòu)建含有NALP3-LRR序列的pSos誘餌質(zhì)粒 人軟骨組織通過液氮研磨，Trizol法提取總RNA，用Oligo dT為引物，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應。設計含有BamH I和Sal I酶切位點的PCR引物，克隆NALP3-LRR的cDNA序列。將回收的PCR產(chǎn)物與酶切后的線性質(zhì)粒16℃連接過夜。提取質(zhì)粒，酶切鑒定含有NALP3-LRR的陽性克隆。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切鑒定選擇適當?shù)目寺〗?jīng)測序確認。

2.2 酵母轉(zhuǎn)化和誘餌蛋白自激活實驗 常規(guī)制備感受態(tài)細胞，行酵母轉(zhuǎn)化實驗。設置陽性對照組為pSos MAFB+pMyr MAFB和pSos MAFB+pMyr SB;陰性對照組為pSos MAFB+pMyr Lamin C和pSos Col I+pMyr MAFB，只有在galactose存在的前提下才能激活報告基因的表達。為了驗證Bait蛋白NALP3-LRR是否具有自激活能力，設置轉(zhuǎn)化組別為:pSos bait(用于排除bait蛋白自身可定位于膜上)，pSos bait+pMyr SB(驗證蛋白位于胞漿中)，pSos bait+pMyr或pMyr Lamin C(排除bait蛋白可能與myristlyation signal結(jié)合)。將在 25 ℃ SD/glucose(－UL)平板上生長的酵母菌挑取在DDW中渦旋后各滴于 SD/glucose(－UL)和 SD/galactose(－UL)的平板上，25℃ 和37℃觀察4～6 d。

2.3 感受態(tài)酵母菌的制備及質(zhì)量評價 使用2個對照平板來檢測溫度敏感突變體的突變頻率。第1對照組將75 μL用來制備酵母感受態(tài)的酵母培養(yǎng)物鋪于YPAD完全培養(yǎng)平板上，在37℃孵育6 d，出現(xiàn)5個克隆(小于30個克隆)，說明培養(yǎng)物中溫度敏感突變體的數(shù)量合格。第2對照平板為共轉(zhuǎn)化pSos和pMyr的酵母細胞，37℃孵育6 d，未出現(xiàn)克隆，符合要求。共轉(zhuǎn)化了pSos和pMyr的酵母細胞，在25℃孵育的SD/glucose(－UL)平板上生長的克隆數(shù)為130左右。按公式計算轉(zhuǎn)化效率為1.3×103cfu/μg，符合轉(zhuǎn)化效率應在0.5 ×103～1 ×104cfu/μg的要求。

2.4 酵母的文庫篩選實驗 將NALP3-LRR-pSos質(zhì)粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母的感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化反應混合物鋪在SD/galactose(－UL)瓊脂平板上。25℃倒置孵育平板48 h，隨后轉(zhuǎn)入37℃孵育。7 d以后，從37℃半乳糖平板上的文庫篩選轉(zhuǎn)化物中挑取克隆，將細胞重鋪在SD/glucose(－UL)瓊脂平板上，在22～25℃孵育48 h。再將其分別重鋪在2個SD/glucose(－UL)平板和1個SD/galactose(－UL)平板上，其中一個SD/glucose(－UL)平板在25℃孵育作為保存板，另外一個SD/glucose(－UL)平板和SD/galactose(－UL)平板在37℃孵育約48 h。48 h后觀察各個平板的克隆生長情況，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長、而在SD/glucose(－UL)平板上不生長的克隆。將這些克隆再次鋪板，置不同溫度培養(yǎng)，重復驗證后視為可能的陽性克隆。

2.5 陽性克隆的酵母回交驗證實驗 擴增含有陽性克隆的酵母細胞后通過化學及物理裂解的方法提取其中的文庫質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化上述質(zhì)粒DNA至大腸桿菌后，分離純化文庫質(zhì)粒DNA。酶切鑒定文庫質(zhì)粒DNA中所含外片段的大小進行比對分析。再次共轉(zhuǎn)文庫與誘餌DNA，對篩選得到的陽性克隆進行回交驗證。最后測序分析陽性克隆的序列并做生物信息學分析。

2.6 NALP3-LRR與陽性克隆基因在293T細胞的共表達和免疫共沉淀驗證 對經(jīng)酵母文庫篩選獲得的陽性蛋白進行基因序列克隆，構(gòu)建相應的真核表達載體，經(jīng)酶切鑒定后送測序確認。用Lipofectamine 2000將含有相關陽性蛋白基因的真核表達載體與含有NALP3-LRR基因的真核表達載體共轉(zhuǎn)染293T細胞，CO2培養(yǎng)箱37℃ 培養(yǎng)72 h后，裂解細胞提取蛋白。Western blotting檢測相關蛋白在293T細胞中的表達。

分別將NALP3-LRR/pCD3-CMYC與CCNH/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與 AIBVORF1a/pCD3-HA、NALP3-LRR/pCD3-CMYC 與PALM3/pCD3-HA共轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后收獲細胞，加入細胞裂解緩沖液裂解細胞提取蛋白。取 c-Myc單抗交聯(lián)蛋白A瓊脂糖珠，用裂解緩沖液洗3次，將預處理過的蛋白A瓊脂糖珠加入和抗體孵育過夜的細胞裂解液中，4℃ 緩慢搖晃孵育4 h，使抗體與蛋白A瓊脂糖珠偶聯(lián)。免疫沉淀反應后，4℃、3 000 r/min離心將瓊脂糖珠離心至管底，小心吸去上清，瓊脂糖珠用裂解緩沖液洗，最后加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min。配制分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后100V電壓電泳。電泳分離后的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，浸入Blotto封閉液封閉非特異性結(jié)合位點，分別與Ⅰ抗和Ⅱ抗孵育，最后加入化學發(fā)光底物檢測顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.7 用分子模擬軟件Discovery StudioTM(Accelrys)對NALP3-LRR進行三維結(jié)構(gòu)模建，使用Vector NTI Suite軟件、ExPASy的PROSITE數(shù)據(jù)庫、DTU CBS服務器上的NetPhos 2.0 Server程序和Stanford大學開發(fā)的SAPS等工具和數(shù)據(jù)庫分析NALP3-LRR序列的功能位點。

結(jié) 果

1 NALP3-LRR的cDNA序列克隆和NALP3-LRR-pSos誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

常規(guī)方法提取總 RNA，A260/A280=1.9，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，28S/18S大約為1∶1～2∶1之間。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定片段大小正確，見圖1A。將NALP3-LRR序列與誘餌載體pSos連接，酶切后電泳鑒定，顯示1、3、5號克隆含有大小正確的目的片段，見圖1B，其中1號克隆經(jīng)測序確認序列無誤，讀碼框正確，用于后續(xù)實驗。

Figure 1.Identification of PCR clone of NALP3－LRR cDNA(A)and NALP3－LRR－pSos bait plasmid(B)by enzyme digestion with BamH I and Sal I.M:DNA marker.圖1PCR克隆的NALP3-LRR cDNA序列和NALP3-LRR-pSos誘餌質(zhì)粒的酶切鑒定

2 酵母轉(zhuǎn)化和自激活實驗

將cdc25H酵母細胞分別畫線于 SD/－Trp、SD/－Leu、SD/－His、SD/－Ura和 YPDA，22 ～25 ℃下生長4～6 d。結(jié)果只在YPDA上長出克隆，其余SD平板上均無克隆出現(xiàn)。將cdc25H酵母細胞分別畫線于2塊YPDA平板，一個放于22～25℃培養(yǎng)，另一個放于37℃培養(yǎng)，共觀察4 d，37℃條件下無菌落生長。

酵母轉(zhuǎn)化對照實驗表明，只有在galactose存在的前提下才能激活報告基因的表達，實際結(jié)果與預期結(jié)果相符，見表1。

表1 酵母轉(zhuǎn)化證實galactose的存在激活報告基因Table 1.Yeast transformation indicated galactose activated the reporter gene

自激活實驗結(jié)果顯示，2組轉(zhuǎn)化后的酵母菌25℃在glucose和galactose平板上均有生長;37℃在glucose平板上，2組均無生長。在galactose平板上，NAPL3-LRR-pSos+pMyr SB生長，而NAPL3-LRR-pSos+pMyr Lamin C不生長，表明NALP3無自激活作用，可用于酵母文庫篩選實驗，見圖2。

Figure 2.The growth of the co-transformants under different conditions for testing the possibility of self-activation by NALP3-LRR.1:NALP3-LRR-pSos+pMyr Lamin C;2:NALP3-LRR-pSos+pMyr SB.圖2 自激活實驗顯示共轉(zhuǎn)子在不同條件下的生長情況

3 從人胚肺cDNA文庫篩選與NALP3-LRR相互作用的陽性克隆

將NALP3-LRR-pSos質(zhì)粒和pMyr人胚肺cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化后的酵母的感受態(tài)細胞按照方法2.4培養(yǎng)，找出37℃下在SD/galactose(－UL)平板上生長，而在SD/glucose(－UL)平板上不生長的克隆，再次驗證后視為可能的陽性克隆，圖3是部分陽性克隆的例子，可見第2號克隆在 SD/glucose(－UL)條件下，25℃能正常生長，37℃則無法生長。該克隆在SD/galactose(－UL)條件下，37℃也能生長。將選中的克隆重新培養(yǎng)篩選驗證，共得到4個陽性克隆。擴增4個陽性克隆的酵母細胞提取其中含有的文庫質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞后小量提取質(zhì)粒。用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，片段大小與預測相符?；亟粚嶒炦M一步證明所選克隆與NALP3-LRR在酵母細胞內(nèi)有相互作用，見圖4。

Figure 3.Identification and selection of a positive clone.圖3 鑒別和挑選陽性克隆

Figure 4.Further confirmation of the positive clones by the yeast backcross verification.圖4 回交實驗進一步驗證陽性克隆

陽性克隆經(jīng)測序和生物信息學分析表明，克隆N1為人細胞周期蛋白H(Homo sapiens cyclin H，CCNH);克隆 N2為 Homo sapiens paralemmin-3(PALM3);克隆N5為KRAS，是Cytotrap系統(tǒng)中一背景性假陽性蛋白;克隆N6為禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，AIBV)Ca199毒株的ORF1a蛋白(AIBV-ORF1a)。

4 與NALP3-LRR相互作用的蛋白質(zhì)在人腎上皮細胞的表達及免疫共沉淀驗證

成功構(gòu)建相應的真核表達載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC、CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和AIBV-ORF1a/pCD3-HA，經(jīng)酶切后均可見到大小正確的插入片段。測序結(jié)果顯示序列正確，無任何突變或缺失，讀碼框正確。轉(zhuǎn)染293T細胞后，經(jīng)Western blotting獲得單一清晰條帶證實這些蛋白均能在人腎上皮細胞表達，見圖5。

Figure 5.The expression of positive proteins in 293T cells detected by Western blotting.圖5 蛋白印跡實驗證實篩選的陽性蛋白均能在人腎上皮細胞293T表達

將真核表達載體NALP3-LRR/pCD3-CMYC分別與 CCNH/pCD3-HA、PALM3/pCD3-HA 和 AIBVORF1a/pCD3-HA共轉(zhuǎn)染293T細胞后，細胞裂解物和經(jīng)CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合的沉淀物均可檢測到NALP3-LRR蛋白的存在(圖略)。NALP3-LRR基因與CCNH基因共轉(zhuǎn)染的細胞裂解物和NALP3-LRR基因與AIBV-ORF1a基因共轉(zhuǎn)染的細胞裂解物經(jīng)與CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合后，在瓊脂糖珠結(jié)合物中均可檢測到2種蛋白的存在，表明2種蛋白之間存在相互作用。NALP3-LRR與PALM3基因共轉(zhuǎn)染的細胞裂解物與CMYC單抗瓊脂糖珠結(jié)合后，在瓊脂糖珠結(jié)合物中只能檢測到NALP3-LRR的存在，未檢出PALM3蛋白，表明2種蛋白之間沒有相互作用，見圖6。

Figure 6.Co-immunoprecipitation of NALP3-LRR with the positive proteins.The anti-HA antibody was used as the first antibody for binding to the positive proteins.Lane 1:the sample was the cell lysate before co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody;Lane 2:the sample was the precipitates of the cell lysate after co-IP by Sepharose 4B conjugated with the anti-CMYC antibody.圖6 免疫共沉淀實驗確認與NALP3-LRR相互作用的蛋白

5 NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域的分子模擬和功能預測

雖然NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸，但無亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。對NALP3的分子基序搜尋顯示N-糖基化位點(N-glycosylation site)主要位于LRR結(jié)構(gòu)域，原核生物膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(prokaryotic membrane lipoprotein lipid attachment site)也位于LRR結(jié)構(gòu)域(第831～841位氨基酸)，并存在12個可能的磷酸化位點。分子結(jié)構(gòu)保守性分析結(jié)果表明，LRR結(jié)構(gòu)域在整個NALP3分子中保守性最高。對NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域的三維分子模建可見該結(jié)構(gòu)域有典型的TLR胞外PAMPs識別的相似結(jié)構(gòu)，其外緣為α螺旋，內(nèi)緣為β折疊，兩者交替反相折疊呈馬蹄形。該區(qū)負電荷分布占明顯優(yōu)勢，重心位于近羧基β折疊及β折疊的羧基端轉(zhuǎn)彎部位，整個模建的負靜電勢分布呈拳擊手套狀，有正電勢分布位于手套掌根部。

討 論

運用酵母雙雜交技術，本文首次發(fā)現(xiàn)在酵母細胞和人腎上皮細胞內(nèi)，人NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域蛋白與人細胞周期蛋白H和禽傳染性支氣管炎病毒發(fā)生了相互作用。為了確保研究結(jié)果的準確性，在實驗過程中采取了嚴格的質(zhì)量控制措施，所有DNA克隆產(chǎn)物都在酶切鑒定后經(jīng)序列測定確認，保證序列正確，無任何突變或缺失且讀碼框正確，能表達正確的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交對人胚肺cDNA文庫的篩選每個實驗均設置嚴格對照，排除了NALP3-LRR蛋白自激活的可能性。對能與NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域蛋白相互作用的陽性克隆采用了重復實驗、回轉(zhuǎn)實驗，最后共轉(zhuǎn)染人腎上皮細胞293T通過免疫共沉淀檢驗方予確認。

NALP3是NALP分子家族的典型代表，其N端是PYRIN結(jié)構(gòu)域，C端是LRR結(jié)構(gòu)域，NACHT結(jié)構(gòu)域位于分子的核心部位，這樣的結(jié)構(gòu)使其既有信號識別能力，又有自身寡聚化和與效應分子形成復合物的功能，是構(gòu)成炎癥復合體的重要成分。本實驗室曾報道NALP3的NACHT結(jié)構(gòu)域存在能與ATP和Mg2+結(jié)合的Walker A和Walker B基序，該基因的主要致病突變點與此結(jié)構(gòu)有密切關系。同時發(fā)現(xiàn)LRR區(qū)域存在與Ca2+和多糖結(jié)合的位點［13］。

對PYRIN結(jié)構(gòu)域的效應關聯(lián)機制和NACHT結(jié)構(gòu)域的同源寡聚化已有較多的研究資料，但至今尚缺少關于NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域識別PAMPs和與胞內(nèi)危險信號相互作用的直接證據(jù)。雖然大量的研究已明確細胞內(nèi)多種PAMPs和細胞損傷產(chǎn)生的信號分子可激活NALP3炎癥復合體，這些信號分子是否通過LRR結(jié)構(gòu)域進行識別尚屬推測。本研究證明NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域能識別蛋白質(zhì)分子，這種物理性相互作用對該結(jié)構(gòu)域是NALP3分子的信號識別機構(gòu)的觀點提供了重要的證據(jù)。而我們對LRR結(jié)構(gòu)域的分子模擬分析提示該區(qū)域是整個NALP3分子中保守性最高的部分，特殊的電荷分布使其易于通過電荷相互作用與其它分子相結(jié)合。LRR結(jié)構(gòu)域的多個糖基化位點和磷酸化位點提示某種調(diào)節(jié)機制的存在。NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域和TLR胞外段能與PAMPs識別的LRR結(jié)構(gòu)域相似［14］，外緣為α螺旋，內(nèi)緣為β折疊，兩者交替反相折疊的馬蹄形結(jié)構(gòu)也易于形成口袋狀的活性中心。

NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域能識別AIBV-ORF1a蛋白，和人們長期以來認為該分子結(jié)構(gòu)是細胞內(nèi)PAMPs感受器的推測相符。AIBV是冠狀病毒(coronavirus)家族成員，屬于包膜型正鏈RNA病毒，ORF1a基因是冠狀病毒的保守基因。AIBV感染是對各種家禽威脅最大的呼吸系統(tǒng)傳染致病原?；蚪M數(shù)據(jù)分析顯示，SARS冠狀病毒與AIBV冠狀病毒北京分離株存在50%的同源性［15］，SARS冠狀病毒與多個AIBV病毒株存在不同程度的序列重組現(xiàn)象，氨基酸取代類型上也有較大的相似性［16］?？茖W家在研制針對SARS冠狀病毒的疫苗時都重視借鑒過往制備AIBV疫苗的經(jīng)驗［17］。雖然AIBV并非人類的致病病毒，了解NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域識別AIBV病毒蛋白的意義，在于對呼吸系統(tǒng)有感染能力的冠狀病毒對人類的威脅越來越大，本實驗結(jié)果為探討機體識別這一類病原體并啟動固有免疫機制提供了新思路，對研究病毒性呼吸系統(tǒng)感染的治療和相關疫苗的制備，以及對人類抗御傳染性呼吸道致病原，提高自身抵抗力均有重要意義。

細胞周期蛋白H為單域結(jié)構(gòu)，是動植物普遍存在的細胞周期蛋白，在細胞周期的各個時相均有表達，通過與CDK7結(jié)合形成CAK，促進多個CDK的磷酸化，參與細胞周期的調(diào)節(jié)。人細胞周期蛋白H能與P53蛋白直接相互作用，使之磷酸化，促進細胞增殖。至今，尚未有關于人細胞周期蛋白H直接參與固有免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應的報道。眾所周知，增生是炎癥反應的主要病理過程之一，大量研究資料表明，炎癥反應影響細胞周期蛋白的表達［18］;使用細胞周期抑制劑能減輕炎癥性神經(jīng)損傷和肺損傷;克氏錐蟲感染可刺激細胞增生，細胞周期蛋白表達上調(diào)，感染細胞呈炎癥表型［19-21］;細胞周期抑制性調(diào)節(jié)物p21也能抑制巨噬細胞生成IL-1β［22］。有報道稱NALP3的炎癥復合體機制還參與了代謝綜合癥、II型糖尿病、器官重塑性疾病如動脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病過程，由此引起的細胞增殖過程異常理應有細胞周期蛋白的參與。既然人細胞周期蛋白H調(diào)節(jié)多種細胞周期蛋白的活性，其作為參與炎癥反應和固有免疫調(diào)節(jié)的可能性也是存在的。值得注意的是，細胞周期蛋白H大多定位于細胞核［23］，與本實驗NALP3-LRR蛋白定位于胞漿及膜結(jié)構(gòu)有區(qū)別。NALP3可能通過對細胞周期蛋白H的識別影響其入核發(fā)揮作用，進而影響細胞增殖進程，或者細胞周期蛋白H還具有與周期調(diào)節(jié)不同的功能也是值得深入研究的新課題。例如，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的定位和功能就主要在細胞核內(nèi)，但某些組織細胞在特定情況下能主動分泌HMGB1到胞外誘發(fā)炎癥反應并能被TLR識別。本實驗室曾報道PYRIN蛋白家族成員存在較復雜的基因多態(tài)性變化［24］，深入探討NALP3-LRR與細胞周期蛋白H的相互作用將有助于闡明固有免疫和細胞增殖的關系和調(diào)節(jié)機制。

雖然我們的研究在細胞水平(包括酵母細胞和人腎上皮細胞)上證實NALP3-LRR結(jié)構(gòu)域與人細胞周期蛋白H和AIBV-ORF1a蛋白存在相互作用，但實驗條件是處于體外人工轉(zhuǎn)染高表達狀態(tài)下。進一步研究在生理及病理狀態(tài)下NALP3分子與這些蛋白的相互作用將有助于闡明NALP3作為細胞內(nèi)危險信號感受器的識別機制。

［1］ Rock FL，Hardiman G，Timans JC，et，al.A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(2):588-593.

［2］ Akira S，Takeda K，Kaisho T.Toll-like receptors:critical proteins linking innate and acquired immunity［J］.Nat Immunol，2001，2(8):675-680.

［3］ Hoffman HM，Wright FA，Broide DH，et al.Identification of a locus on chromosome 1q44 for familial cold urticaria［J］.Am J Hum Genet，2000，66(5):1693-1698.

［4］ Hoffman HM，Mueller JL，Broide DH，et al.Mutation of a new gene encoding a putative pyrin-like protein causes familial cold autoinflammatory syndrome and Muckle-Wells syndrome［J］.Nat Genet，2001，29(3):301-305.

［5］ Neven B，Callebaut I，Prieur AM，et al.Molecular basis of the spectral expression of CIAS1 mutations associated with phagocytic cell-mediated autoinflammatory disorders CINCA/NOMID，MWS，and FCU ［J］.Blood，2004，103(7):2809-2815.

［6］ Martinon F，Hofmann K，Tschopp J.The pyrin domain:a possible member of the death domain-fold family implicated in apoptosis and inflammation ［J］.Curr Biol，2001，11(4):R118-R120.

［7］ Koonin EV，Aravind L.The NACHT family-a new group of predicted NTPases implicated in apoptosis and MHC transcription activation［J］.Trends Biochem Sci，2000，25(5):223-224.

［8］ Kajava AV.Structural diversity of leucine-rich repeat proteins［J］.J Mol Biol，1998，277(3):519-527.

［9］ Dowds TA，Masumoto J，Zhu L，et al.Cryopyrin-induced interleukin 1 beta secretion in monocytic cells:enhanced activity of disease-associated mutants and requirement for ASC［J］.J Biol Chem，2004，279(21):21924-21928.

［10］ Mariathasan S，Weiss DS，Newton K，et al.Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP［J］.Nature，2006，440(7081):228-232.

［11］ Martinon F，Petrilli V，Mayor A，et al.Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome ［J］.Nature，2006，440(7081):237-241.

［12］ Kanneganti TD，Ozoren N，Body-Malapel M，et al.BacterialRNA and smallantiviralcompounds activate caspase-1 through cryopyrin/Nalp3 ［J］.Nature，2006，440(7081):233-236.

［13］ 蔡軍偉，韓麗芳，顏 亮.LPS對人CIAS1基因表達的影響及NACHT區(qū)的序列分析［J］.中國病理生理雜志，2006，22(6):1112-1118.

［14］ Pan X，Yue J，Ding G，et al.Leucine-rich repeat 11 of Toll-like receptor 9 can tightly bind to CpG-containing oligodeoxynucleotides，and the positively charged residues are critical for the high affinity［J］.J Biol Chem.2012，287(36):30596-30609.

［15］ 金渭武，陳 晨，張 瑩，等.雞傳染性支氣管炎冠狀病毒北京分離株全基因組序列的測定及其特征分析［J］.科學通報，2004，49(4):352-357.

［16］ Shi P，Yu L，F(xiàn)u YX，et al.Evolutionary implications of avian infectious bronchitis virus(AIBV)analysis［J］.Cell Res，2006，16(3):323-327.

［17］ Cavanagh D.Severe acute respiratory syndrome vaccine development:experiences of vaccination against avian infectious bronchitis coronavirus［J］.Avian Pathol，2003，32:567-582.

［18］ 韓曙光，呂蓓麗，丁曉婧，等.H2型松弛素對慢性支氣管哮喘小鼠氣道重塑與肺組織細胞周期蛋白D1表達的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35(5):349-354.

［19］ Tian DS，Xie MJ，Yu ZY，et al.Cell cycle inhibition attenuates microglia induced inflammatory response and alleviates neuronal cell death after spinal cord injury in rats［J］.Brain Res，2007，1135(1):177-185.

［20］ Hoogendijk AJ，Roelofs JJ，Duitman J，et al.R-roscovitine reduces lung inflammation induced by lipoteichoic acid and streptococcus pneumoniae［J］.Mol Med，2012，18(1):1086-1095.

［21］ Nagajyothi F，Desruisseaux MS，Thiruvur N，et al.Trypanosoma cruzi infection of cultured adipocytes results in an inflammatory phenotype［J］.Obesity，2008，16(9):1992-1997.

［22］ Scatizzi JC，Mavers M，Hutcheson J，et al.The CDK domain of p21 is a suppressor of IL-1β-mediated inflammation in activated macrophages［J］.Eur J Immunol，2009，39(3):820-825.

［23］ 馬雅婷，趙 晶，楊 光，等.人 CtBP2與CCNH相互作用的初步研究［J］.復旦學報，2007，46(3):395-400.

［24］ 韓麗芳，蔡軍偉，顏 亮，等.中國人群MEFV基因多態(tài)性研究［J］.實用醫(yī)學雜志，2006，22(11):1234-1235.