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    MicroRNA-100對肝癌細胞增殖活力和細胞周期的影響*

    2013-11-07 06:02:40嵇曉輝范秉琳張紅鴿蔡新華朱武凌
    中國病理生理雜志 2013年1期
    關鍵詞:脂質(zhì)體抑制率細胞周期

    嵇曉輝, 范秉琳, 張紅鴿, 蔡新華, 朱武凌

    (新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,河南新鄉(xiāng)453003)

    MicroRNAs(miRNAs)是一類短小(20~24 nt)的非編碼RNA,通過影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯而參與多細胞生物體中基因表達的轉錄后調(diào)控。MicroRNA-100(miR-100)在人類定位于 11q24.1,研究表明它在鼻咽癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達,失去對靶基因Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1,Plk1)的調(diào)控,因而Plk1表達上調(diào),這種改變不僅參與癌的發(fā)生過程,而且可能與腫瘤的進展密切相關[1-3]。目前尚不十分清楚miR-100對肝癌細胞的生物學作用及其分子機制,本實驗采用陽離子脂質(zhì)體Oligofectamine介導,將人工化學合成的miR-100模擬物瞬時轉染人肝癌HepG2細胞中,分析肝癌細胞的增殖活力、細胞周期和Plk1的表達情況,以期能夠揭示miR-100對肝癌細胞的作用與機制。

    材料和方法

    1 細胞培養(yǎng)

    人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),選用對數(shù)生長期細胞進行轉染實驗。

    2 miRNA-100的合成及實驗分組

    根據(jù) miR-100的核苷酸序列:5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3',由大連寶生物公司合成帶有熒光素Cy3標記的miRNA-100模擬物以及陰性對照,同時實驗附設單純脂質(zhì)體對照。

    3 細胞轉染

    按照陽離子脂質(zhì)體Oligofectamine試劑(Invitrogen)的操作說明進行,將85 μL培養(yǎng)液Opti-MEM與20 μmol/L miR-100模擬物和陰性對照各5 μL充分混和,與脂質(zhì)體/Opti-MEM混合物再次混合,將最終混合物加入含新鮮Opti-MEM培養(yǎng)基的肝癌HepG2細胞中,轉染終濃度為100 nmol/L,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h。

    4 細胞增殖抑制率測定

    細胞培養(yǎng)于96孔板中,5×103cells/well,培養(yǎng)24 h后進行轉染,轉染后24 h、48 h及72 h,加入細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)溶液10 μL后繼續(xù)培養(yǎng)3 h,酶標儀檢測波長450 nm處各孔吸光度(A)。細胞生長抑制率(%)=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100% 。

    5 流式細胞術分析

    于4℃、75%乙醇中固定收集細胞8 h。離心后將細胞重新懸浮于含有200 mg/L RNA酶及15 mg/L碘化丙啶的PBS中,室溫孵育30 min后,通過流式細胞儀(Beckman Coulter)進行細胞周期分析,檢測重復3次。細胞增殖指數(shù)的計算方法為:(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)。

    6 實時熒光定量RT-PCR檢測

    采用 Trizol試劑(Invitrogen)提取實驗各組HepG2細胞的總RNA,紫外檢測儀分別在260 nm和280 nm波長下檢測RNA的濃度及純度。用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA,以此為模板進行實時熒光定量PCR擴增。Plk1上游引物5'-CCTCTCACAGTCCTTAATAA-3',下游引物 5'-TGTCCGAATAGTCTACCC-3'。實驗同步以 β-actin作為內(nèi)參照,上游引物5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3',下游引物 5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3'。mRNA表達量的分析采用比較Ct數(shù)據(jù)法(2-ΔΔCt)進行。每組實驗重復3次。

    7 Western blotting分析

    按蛋白提取試劑盒(Thermo)說明書進行并測定濃度,取60 μg蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳完成后將蛋白轉至PVDF膜。封閉、抗體孵育及顯色按照One-Step Western試劑盒(GenScript)說明進行,Plk1Ⅰ抗(Abcom)工作濃度為1∶600,結果采用Quantity One凝膠圖像處理軟件進行分析。

    8 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 17.0軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 肝癌細胞轉染

    人工合成Cy3熒光標記的miR-100模擬物轉染HepG2細胞,培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,可見大部分細胞內(nèi)有紅色熒光,見圖1,轉染效率大于85%。

    Figure 1.HepG2 cells transfected by miR-100 mimic(labeled with Cy3 fluorescent dye).圖1 Cy3熒光標記的miR-100模擬物轉染HepG2細胞

    2 肝癌細胞增殖活力

    用CCK-8法分析轉染后24 h、48 h和72 h的細胞增殖活力,測得實驗組和對照組細胞450 nm波長處各孔A值,計算出細胞增殖抑制率,見表1。同對照組細胞相比,實驗組細胞在miR-100轉染后各時點的增殖抑制率均顯著升高(P<0.01)。

    表1 HepG2細胞轉染后各檢測時點細胞增殖抑制率Table 1.Inhibitory rate of cell proliferation in transfected HepG2 cells(%.Mean±SD.n=3)

    3 細胞周期分析

    流式細胞術檢測結果顯示,實驗組細胞在轉染后72 h G0/G1、S和G2/M期細胞分布發(fā)生了改變,S期和G2/M期細胞比例下降,其細胞增殖指數(shù)(35.8±1.4)較陰性對照組(39.2 ±1.0)和單純脂質(zhì)體組(40.7 ±2.0)減小 (P <0.05)。

    4 Plk1表達情況

    通過qRT-PCR檢測和Western blotting相對灰度值分析,在轉染后72 h miR-100實驗組癌細胞Plk1 mRNA表達水平較各對照組降低,見圖2,同樣Plk1蛋白表達也明顯減少,見圖3。

    Figure 2.Plk1 mRNA expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfected with miR-100 minic for 72 h.Plk1 mRNA expression was determined by real-time RT-PCR.Mean ±SD.n=3.**P <0.01 vs blank control,liposome or negative control.圖2 HepG2細胞經(jīng)轉染后72 h Plk1 mRNA的表達分析

    討 論

    肝癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一,每年因肝癌死亡約11萬人,占全球肝癌死亡總數(shù)的45%,嚴重威脅著人民群眾的身體健康。目前在臨床上主要有外科切除、化療、TACE等治療,盡管它們能延長部分患者的生存時間,但是都不能取得滿意的結果。隨著在分子水平上對肝癌研究的不斷進展,基因治療成為臨床應用前景最為看好的靶向治療,尋找基于新機制的治療手段一直是國內(nèi)外研究的熱點[4-5]。

    Figure 3.Plk1 protein expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfented with miR-100 minics for 72 h,Plk1 protein was determined by Western blotting assay.A:blank control;B:liposome;C:negative control;D:miR-100.Mean ± SD.n=3.**P <0.01 vs A,B or C.圖3 HepG2細胞經(jīng)轉染后72 h Plk1蛋白表達分析

    近年來研究表明,miRNAs在肝細胞癌中表達異常,導致癌基因的激活上調(diào)和抑癌基因的功能缺失,從而調(diào)控癌細胞增殖和腫瘤生長[6-7]。Li等[8]分析發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中miR-224高表達對細胞增殖、分化及轉移產(chǎn)生影響,但細胞周期并無明顯變化。在本研究中,我們以陽離子脂質(zhì)體Oligofectamine為介導,用人工合成的miR-100寡聚核苷酸瞬時轉染人肝癌HepG2細胞,旨在揭示miR-100對肝癌細胞的生物學作用。經(jīng)CCK-8方法檢測發(fā)現(xiàn),miR-100實驗組在轉染后24 h、48 h和72 h的細胞增殖抑制率較其它各對照組均有顯著上升,說明肝癌細胞的增殖活力受到miR-100的影響而減低。同時流式細胞術分析結果顯示,miR-100實驗組的細胞周期分布在轉染后72h發(fā)生改變,處于S期和G2/M期的細胞比例下降,細胞增殖指數(shù)減小,說明miR-100的轉染引起了肝癌細胞的細胞周期變化。由此可見miR-100參與肝癌細胞的增殖和細胞周期調(diào)控。

    Plk1是一種有絲分裂調(diào)控蛋白,在有絲分裂進展中起到十分重要的作用,其高表達會促進染色體不穩(wěn)定和非整倍體產(chǎn)生。現(xiàn)已證實Plk1在許多癌癥中異常表達,通過shRNA或化學抑制劑阻斷Plk1的表達或降低其激酶活性,無論是在體外和體內(nèi)都可以有效遏制細胞增殖和腫瘤生長,更有意義的是,這種抑制作用可優(yōu)先殺死癌細胞,而對于正常細胞并無大礙[9-12],因此Plk1成為一個理想的腫瘤基因治療新靶點。本實驗針對Plk1受miR-100調(diào)控,運用轉染技術成功建立miRNA干擾模型,經(jīng)qRT-PCR和Western blotting的檢測分析,結果表明miR-100寡核苷酸轉染抑制了Plk1基因的表達,勢必影響細胞有絲分裂,從而對癌細胞的增殖產(chǎn)生阻滯作用,這為進一步探索肝癌的靶向治療提供了新的途徑。

    [1] Shi W,Alajez NM,Bastianutto C,et al.Significance of Plk1 regulation by miR-100 in human nasopharyngeal cancer[J].Int J Cancer,2010,126(9):2036-2048.

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    [4] 余桂芳,嚴躍紅,王瑞鑫,等.不同缺氧狀態(tài)對人肝癌HepG2細胞侵襲和轉移能力的影響[J].中國病理生理雜志,2012,28(2):281-286.

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