p-p38 MAPK在A2AR敲除新生小鼠缺氧缺血腦區(qū)的表達(dá)及意義*

任素偉， 崔志慧， 黃托夫， 范海玲， 陳江帆， 王小同， 陳 翔△

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院康復(fù)科，浙江溫州325027;2波士頓大學(xué)分子神經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，美國波士頓02118)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy)是新生兒期的危重病，有較高的致死率和致殘率，往往給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。目前，雖有大量相關(guān)研究，但臨床上仍缺乏特異性治療方法。缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為在未成熟腦神經(jīng)細(xì)胞死亡中起主導(dǎo)作用［1-2］，而caspase-3在未成熟腦HIBD后皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中扮演重要角色［3］。Caspase-3在機(jī)體內(nèi)以無活性的酶原形式存在，當(dāng)受到缺氧等刺激時(shí)，將被激活，執(zhí)行凋亡程序。細(xì)胞凋亡過程涉及多種信號(hào)通路的參與，p38 MAPK便是其中之一。作為重要的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，p38 MAPK信號(hào)通路激活主要參與不同刺激下的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程等［4］，如缺氧缺血等多種應(yīng)激刺激可磷酸化 p38 MAPK，繼而作為上游因子，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生［5］。而缺氧缺血后，能量代謝紊亂，ATP大量降解，致使腺苷大量釋放，選擇性作用于腺苷受體，在已知的4種受體亞型(A1R、A2AR、A2BR和A3R)中，A2AR因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)復(fù)雜而重要的作用，成為關(guān)注熱點(diǎn)。Melani等［6］發(fā)現(xiàn)選擇性A2AR拮抗劑SCH58261可有效減少腦缺血后24 h的梗死面積，這一過程涉及pp38 MAPK的參與。研究表明，A2AR拮抗劑與A2AR基因敲除均在成年鼠局灶性腦缺血損傷中起神經(jīng)保護(hù)作用［7-9］;然而A2AR在新生鼠中HIBD的作用尚存爭(zhēng)議:A2AR拮抗劑可減輕新生鼠HIBD后的腦損害，?dén 等［10］卻發(fā)現(xiàn) A2AR 基因敲除加重了新生鼠HIBD后腦損傷程度。為此，本實(shí)驗(yàn)采用改良Rice法建立新生鼠HIBD模型，以對(duì)缺血刺激敏感的皮層及海馬CA1區(qū)作為研究腦區(qū)，探討 p-p38 MAPK在A2AR敲除新生小鼠HIBD后的表達(dá)及意義，旨在明確A2AR敲除對(duì)新生小鼠HIBD的作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床提供新的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 選擇7日齡新生C57/BL6小鼠，雌雄不限，按以下標(biāo)準(zhǔn)篩選入組動(dòng)物:(1)小鼠體重需在(3.0±0.5)g范圍內(nèi);(2)平面翻正反射成績(jī)高于正常值2倍或2倍以上的小鼠要剔除。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗鼠 p-p38 MAPK(No.BS4766)多克隆抗體購自 Bioworld;anti-activated caspase-3 antibody(ab2302)購自Abcam;PV-6001二步法試劑盒、DAB底物液和蘇木素復(fù)染劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TUNEL檢測(cè)試劑盒和蛋白酶K均購自Roche;引物購自上海生工生物技術(shù)有限公司;TUNEL檢測(cè)陽性對(duì)照制備試劑盒(C1082)和蘇木素伊紅染液購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;Olympus公司BX51光學(xué)顯微鏡拍攝照片;Image-Pro Plus 6.0(IPP 6.0;Media Cybernetics)彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析圖片;自制小鼠缺氧裝置。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 將A2AR敲除(A2AR-/-，KO)及同期野生型(A2AR+/+，WT)C57/BL6新生小鼠分別按照完全隨機(jī)分組方法分成假手術(shù)組(sham-operated，SKO和SWT)和模型組(model，MKO和MWT)，模型組按HIBD后取標(biāo)本時(shí)間不同又分為造模后1 d組(MKO1和MWT1)、3 d組(MKO3和 MWT3)和7 d組(MKO7和MWT7)，共8個(gè)組，每組8只，共64只，進(jìn)行尼氏染色、TUNEL及免疫組化指標(biāo)檢測(cè)。此外，KO及同期WT小鼠分別取假手術(shù)組各10只及模型組各30只于HIBD后1 d同時(shí)進(jìn)行新生鼠短期神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定。

2.2 模型制備 采用改良Rice法建立新生小鼠HIBD模型。7日齡新生小鼠分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，雙重結(jié)扎，一次性縫合切口，返回母鼠身邊喂養(yǎng)休息后，將其放入37℃恒溫密閉透明缺氧瓶中，吸入8%O2和92%N2的混合氣體1 h。假手術(shù)組模擬分離頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，無缺氧，在模型組HIBD后1 d與其同時(shí)進(jìn)行新生鼠短期神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定。

2.3 神經(jīng)行為學(xué)觀察 (1)缺氧過程全程記錄小鼠的體征變化，包括皮膚顏色變化、活動(dòng)量、有無激惹或嗜睡等。(2)A2AR-/-及A2AR+/+小鼠均隨機(jī)取假手術(shù)組10只及模型組30只，于造模后1 d評(píng)定神經(jīng)反射［11］:a.翻正反射(righting reflex):從小鼠仰臥位置開始計(jì)時(shí)，到小鼠自行翻身成俯臥位、前后爪放平時(shí)計(jì)時(shí)停止;b.懸崖逃避反射(cliff aversion reflex):將小鼠前爪懸于桌面邊緣之外，桌面離地1 m，記錄小鼠扭轉(zhuǎn)身體(＞90°)離開桌面邊緣所用的時(shí)間;c.趨地反射(geotaxis reflex):將小鼠頭朝下置于傾斜度為40°的木板上，記錄小鼠扭轉(zhuǎn)身體(扭轉(zhuǎn)角度＞90°)為頭朝上時(shí)所用的時(shí)間。若b和c項(xiàng)反射在20 s內(nèi)不能完成，所用時(shí)間記為20 s。

2.4 PCR鑒定基因型 取0.5～1 cm小鼠尾巴加入240 μL裂解液和10 μL 蛋白酶 K，55 ℃水浴，振蕩過夜;加入5 moL/L NaCl溶液鹽析;離心后取上清液，加無水乙醇，離心沉淀 DNA;棄去上清，加70%乙醇混勻后離心;棄上清干燥，加1×TE溶解DNA，即可用作PCR反應(yīng)模板。設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為180 bp和330 bp的特異DNA序列作為引物，結(jié)果為180 bp的條帶代表野生型;結(jié)果為2條分別為180 bp和330 bp的條帶代表雜合型;結(jié)果為330 bp的條帶代表敲除型。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為180 bp:正義鏈5'-AGC CAG GGG TTA CAT CTG TG-3'，反義鏈 5'-TAC AGA CAG CCT CGA CAT GTG-3';擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為330 bp:正義鏈5'-TCG GCC ATT GAA CAA GAT GG-3'，反義鏈 5'-GAG CAA GGT GAG ATG AGA GG-3'。采用2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳30 min后凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR反應(yīng)結(jié)果。

2.5 切片制備 每組小鼠至相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(假手術(shù)組同造模后1 d組同時(shí)取材)，以10%水合氯醛麻醉后常規(guī)灌注、取腦，去除嗅球、小腦和腦干，多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋。于視交叉前緣行冠狀位切片，片厚約4 μm，用于進(jìn)行尼氏染色、TUNEL及免疫組化。

2.6 尼氏染色、TUNEL檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡 每只動(dòng)物隨機(jī)取切片5張，常規(guī)脫蠟水化，分別按照尼氏染液及TUNEL試劑盒所示步驟進(jìn)行操作，封片后，在統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×40)下，對(duì)海馬CA1區(qū)和大腦矢狀旁區(qū)皮質(zhì)分別隨機(jī)選取5個(gè)陽性視野，對(duì)每高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.7 免疫組織化學(xué)法觀察活化caspase-3和p-p38 MAPK的表達(dá) 每只動(dòng)物隨機(jī)取切片5張，采用免疫組化二步法檢測(cè)活化caspase-3和p-p38 MAPK的表達(dá)。封片后，在統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×40)下，對(duì)海馬CA1區(qū)和大腦矢狀旁區(qū)皮質(zhì)分別隨機(jī)選取5個(gè)陽性視野，用IPP 6.0分析軟件行圖像分析，測(cè)定吸光度(A)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多個(gè)樣本間均數(shù)的比較用單因素方差分析，兩連續(xù)型變量間的相關(guān)性采用Pearson線性相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)行為學(xué)觀察

1.1 缺氧過程的癥狀 缺氧10 min，動(dòng)物開始煩躁不安;缺氧15～20 min，動(dòng)物出現(xiàn)呼吸加深、加快，口周發(fā)紺;缺氧30 min，大部分動(dòng)物開始站立不穩(wěn)，偶有激惹現(xiàn)象;缺氧40～50 min，大部分動(dòng)物活動(dòng)明顯減少、發(fā)紺明顯;缺氧1 h，幾乎所有小鼠出現(xiàn)不能翻身、嗜睡現(xiàn)象。

1.2 新生小鼠短期神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定 模型組小鼠完成翻正反射、懸崖逃避反射和趨地反射的時(shí)間都明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組小鼠(P＜0.01)，MKO組較MWT組各反射完成的時(shí)間均稍長(zhǎng)(翻正反射:P＜0.01;趨地反射:P ＜0.01;懸崖逃避反射:P ＜0.05)，見表1。

表1 A2AR敲除對(duì)新生小鼠HIBD后短期神經(jīng)行為學(xué)的影響Table 1.The effect of A2AR knockout on the changes of early neurological behavior in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(mean±SD.n=10)

2 基因型鑒定

A2AR+/+:出現(xiàn)180 bp的條帶，為野生型;A2AR+/-:出現(xiàn)2條分別為180 bp和330 bp的條帶，為雜合型;A2AR-/-:出現(xiàn)330 bp的條帶，為敲除型，見圖1。

Figure 1.The result of genotype identification.M:marker;1:A2AR+/-;2:A2AR+/+;3:A2AR+/+;4:A2AR-/-;5:A2A R+/-;6:A2AR+/+;7:A2AR+/-.圖1 基因型鑒定結(jié)果

3 尼氏小體定量分析結(jié)果

假手術(shù)組皮層、海馬CA1區(qū)可見較多深藍(lán)色尼氏小體，SKO組與SWT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIBD后尼氏小體數(shù)目明顯減少，同基因型各時(shí)點(diǎn)比較均有顯著差異(P＜0.01)，其中，又以HIBD后1 d組減少最為明顯。HIBD后同一時(shí)點(diǎn)，KO小鼠皮層和海馬CA1區(qū)尼氏小體均較WT小鼠顯著減少(P＜0.01)，見圖2、表2。

Figure 2.Nissl staining in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(×400).A:the cortex of SKO;B:the cortex of MKO1;C:the cortex of MWT1;D:the hippocampal CA1 region of SKO;E:the hippocampal CA1 region of MKO1;F:the hippocampal CA1 region of MWT1.圖2 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果

表2 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)尼氏小體定量分析Table 2.Number of Nissl body in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(mean±SD.n=8)

4 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

假手術(shù)組皮層和海馬CA1區(qū)均偶可見極少量TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，SKO組與SWT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIBD后，缺氧缺血側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)均顯著增加，1 d后達(dá)高峰，至7 d相比假手術(shù)組仍有顯著差異(P＜0.01)，同基因型模型組各時(shí)點(diǎn)間比較均有顯著差異(P＜0.01)，HIBD后同一時(shí)點(diǎn)，KO小鼠缺氧缺血側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)均較WT小鼠顯著增加(P ＜0.01)，見圖3、表3。

5 缺氧缺血側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)活化caspase-3及p-p38 MAPK的表達(dá)

Figure 3.Apoptosis of the neurons in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage detected by TUNEL assay(×400).A:the cortex of SKO;B:the cortex of MKO1;C:the cortex of MWT1;D:the hippocampal CA1 region of SKO;E:the hippocampal CA1 region of MKO1;F:the hippocampal CA1 region of MWT1.圖3 TUNEL技術(shù)檢測(cè)皮層及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡

表3 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元的數(shù)目Table 3.Number of apoptotic neurons in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(mean±SD.n=8)

假手術(shù)組皮層和海馬CA1區(qū)均偶可見極少量活化caspase-3及p-p38 MAPK表達(dá)，SKO組與SWT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIBD后，缺氧缺血側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)活化caspase-3及p-p38 MAPK的表達(dá)迅速增加，1 d后為高峰，之后逐漸降低，至7 d時(shí)相比對(duì)照組仍有顯著差異(P＜0.01)，同基因型模型組各時(shí)點(diǎn)間比較，差異均顯著(P＜0.01)。HIBD后同一時(shí)點(diǎn)，小鼠缺氧缺血側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)活化caspase-3的表達(dá)均較WT小鼠顯著增加(P＜0.01)。HIBD后同一時(shí)點(diǎn)，KO小鼠p-p38 MAPK表達(dá)均多于WT小鼠，其中HIBD后1 d、3 d兩種基因型間均有顯著差異(P ＜0.01)，見圖4、5 和表4。

6 活化caspase-3表達(dá)與p-p38 MAPK表達(dá)的相關(guān)性分析

各組小鼠皮層和海馬CA1區(qū)活化caspase-3表達(dá)與p-p38 MAPK表達(dá)均呈顯著正相關(guān)(皮層:r=0.957，P ＜0.01;海馬 CA1 區(qū):r=0.939，P ＜0.01)。

Figure 4.The expression of activated caspase-3 in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(×400).A:the cortex of SKO;B:the cortex of MKO1;C:the cortex of MWT1;D:the hippocampal CA1 region of SKO;E:the hippocampal CA1 region of MKO1;F:the hippocampal CA1 region of MWT1.圖4 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)活化caspase-3的表達(dá)

Figure 5.The expression of p-p38 MAPK in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(×400).A:the cortex of SKO;B:the cortex of MKO1;C:the cortex of MWT1;D:the hippocampal CA1 region of SKO;E:the hippocampal CA1 region of MKO1;F:the hippocampal CA1 region of MWT1.圖5 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的表達(dá)

表4 新生小鼠缺氧缺血側(cè)皮層及海馬CA1區(qū)活化caspase-3及p-p38 MAPK的表達(dá)Table 4.The expression of activated caspase-3 and p-p38 MAPK in the cortex and hippocampal CA1 region in neonatal mice after hypoxic-ischemic brain damage(mean±SD.n=8)

討 論

缺氧缺血是新生兒腦損傷的常見原因，目前臨床上尚無特效治療方法，而其高致死率和致殘率又決定了尋求新的治療策略具有重要的臨床意義。新生鼠腦組織發(fā)育不成熟，對(duì)缺氧缺血刺激的病理改變與成年鼠不盡相同，caspase-3在未成熟腦HIBD后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中扮演重要角色，而p38 MAPK磷酸化后可作為上游因子通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)缺氧缺血后，p38 MAPK的抑制劑SB203580可以阻斷Bax從胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)移，減輕腦損害［12-13］，提示p38 MAPK可能間接通過線粒體途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

A2AR作為腺苷4種受體亞型之一，在新生鼠HIBD中的作用尚存爭(zhēng)議。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論證實(shí)，A2AR敲除可加重新生鼠HIBD后的腦損害，影響其短期神經(jīng)行為學(xué)，加速尼氏小體溶解或消失，增加皮層及海馬CA1區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。這一過程，伴隨p-p38 MAPK及活化caspase-3表達(dá)的增加，且二者表達(dá)呈顯著正相關(guān)。提示A2AR敲除可能通過磷酸化p38 MAPK，進(jìn)而活化caspase-3，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但HIBD后，僅在1 d、3 d這2個(gè)時(shí)點(diǎn)，2種基因型間pp38 MAPK的表達(dá)有顯著差異，提示A2AR敲除通過磷酸化p38 MAPK影響神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能主要發(fā)生在腦缺氧缺血早期，這也提示通過A2AR相關(guān)制劑干預(yù)p38 MAPK在未成熟腦HIBD神經(jīng)元凋亡中的作用應(yīng)在HIBD早期進(jìn)行，把握治療時(shí)機(jī)對(duì)減輕腦損傷具有重要意義。

同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)表明，盡管腦缺氧缺血后7 d，2種基因型間p-p38 MAPK的表達(dá)已沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但二者的神經(jīng)元凋亡數(shù)目仍存在顯著差異，提示除外p38 MAPK，A2AR敲除可能也通過激活其它路徑上的蛋白加重腦損害。其中，JNK［14］、p53，NF-κB 等［15］因其在細(xì)胞凋亡中的重要作用，參與此過程中的可能性相對(duì)更大。繼續(xù)探討其它相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)深入闡明A2AR敲除加重新生鼠HIBD腦損傷的作用機(jī)制，具有重要意義。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)論與A2AR敲除在成年鼠缺血損傷中的作用相矛盾，這可能與新生鼠腦組織發(fā)育不成熟有關(guān)。A2AR完全缺失可能導(dǎo)致新生鼠HIBD后突觸前谷氨酸等興奮性遞質(zhì)的過度釋放，進(jìn)而激活了p38 MAPK;而A2AR可影響IL-1、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，炎癥因子亦可作為上游因子激活MAPK家族成員［16］，因此，A2AR敲除也可能通過增加炎癥因子的表達(dá)導(dǎo)致p38 MAPK磷酸化增多。實(shí)驗(yàn)證實(shí)p-p38 MAPK下游可通過誘導(dǎo)Bax易位激活線粒體內(nèi)源性途徑和通過增加c-Fos啟動(dòng)外源性凋亡路徑，這均可能是A2AR敲除導(dǎo)致新生鼠HIBD后p38 MAPK參與的凋亡通路。

我們的實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了p-p38 MAPK在A2AR敲除新生小鼠缺氧缺血腦皮層及海馬CA1區(qū)呈高表達(dá)，且與活化caspase-3表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示p-p38 MAPK可能參與了A2AR敲除增加神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程，且以HIBD早期為著。但這一路徑的中間過程仍有待深究，A2AR激活p38 MAPK的具體機(jī)制及p38 MAPK如何通過下游因子最終激活了caspase-3，仍需進(jìn)一步闡述，從而為圍產(chǎn)期HIBD的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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