響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪多糖提取工藝研究

★ 李曉芳 吳榮 葉喜德

(1.江西省中醫(yī)院 南昌 330006；2.江西省余干縣人民醫(yī)院 余干 335100；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510006)

響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪多糖提取工藝研究

★ 李曉芳1*吳榮2葉喜德3**

(1.江西省中醫(yī)院 南昌 330006；2.江西省余干縣人民醫(yī)院 余干 335100；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510006)

目的： 確定黃芪多糖提取的最佳工藝。方法；方法：采用了苯酚硫酸法對黃芪多糖(APS)的含量進(jìn)行測定，以APS得率為指標(biāo)，擬用響應(yīng)面法對主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并得到回歸模型，以確定黃芪多糖提取工藝。結(jié)果：響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝為：超聲功率600 W，提取時(shí)間45min和料液比 35∶1，黃芪多糖得率為 3.034 %，該回歸模型的預(yù)測值與實(shí)測值的相對誤差<1%，回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。結(jié)論：該法經(jīng)濟(jì)簡便、科學(xué)合理。

黃芪多糖；提?。豁憫?yīng)面法

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. Var. monghlicus (Bge.) Hsiao.或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根。具有補(bǔ)氣升陽、益胃固表、利水消腫等功效，是中國傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學(xué)成分 其中黃芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS) 是黃芪的主要活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心降壓、降血糖、抗應(yīng)激、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化、能促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，可雙向調(diào)節(jié)血糖，延緩細(xì)胞衰老，對心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟等也具有保護(hù)作用[1-3]。目前黃芪多糖國內(nèi)外需求很大，具有廣闊的開發(fā)前景。然而，在黃芪多糖提取工藝中，對其影響的因素較多，如提取溫度、提取時(shí)間及料液比等，必須經(jīng)過大量試驗(yàn)進(jìn)行探索提取的最佳工藝，而大多數(shù)提取工藝的優(yōu)化采用的為正交試驗(yàn)方案等[4]，而響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化多糖提取工藝的研究報(bào)道較少。

響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)，通過一系列確定性實(shí)驗(yàn)，用多項(xiàng)式函數(shù)來近似隱式極限狀態(tài)函數(shù)，通過合理地選取試驗(yàn)點(diǎn)和迭代策略，來保證多項(xiàng)式函數(shù)能夠在失效概率上收斂于真實(shí)的隱式極限狀態(tài)函數(shù)的失效概率。也就是將數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合，采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系[5]，依此可對函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析來尋求最佳工藝參數(shù)。本試驗(yàn)對黃芪多糖的提取，將單因素和響應(yīng)面分析法應(yīng)用于超聲波提取黃芪多糖APS，分析了超聲提取的條件及其對提取結(jié)果的影響。優(yōu)化提取工藝條件，結(jié)果探索出了一條簡單易行、經(jīng)濟(jì)可靠的黃芪多糖提取的技術(shù)路線。

1 儀器與試藥

1. 1 儀器

電子分析天平FA2004，上海天平儀器廠；DKB - 501A型超級恒溫槽(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KQ-500DV臺式數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司) ； 2802UV/VIS分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司) ；8002型恒溫水浴控制器，余姚明偉儀表廠。

1.2 試藥

黃芪(內(nèi)蒙產(chǎn)，購于樟樹，經(jīng)鑒定為豆科植物蒙古黃芪)、95%乙醇、濃硫、苯酚(AR)酸(AR)、蔗糖(AR)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法

精確稱取黃芪根粉5.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入85%乙醇200 mL加熱回流提取1 h，殘?jiān)?0 mL 95%乙醇洗滌兩次，殘?jiān)娓?，加入一定體積的水，超聲提取，合并提取液并濃縮，測定多糖含量。

2. 2 提取率測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[6]：精密稱取于105°C下干燥至恒重的葡萄糖20 mg ，置于500 mL 容量瓶中，加水至刻度；分別吸取0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 mL，并分別配成2.0 mL的水溶液，然后加入6%苯酚1.0 mL 及濃硫酸5.0 mL，靜止10min，搖勻，室溫放置20min 后于490 nm 測光密度，同時(shí)用2.0 mL蒸餾水做空白，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：C = 0.016A - 0.0073，相關(guān)系數(shù)r= 0. 9929。

提取率的測定：采用苯酚-硫酸法[6]，精密吸取樣品溶液1 mL置25 mL容量瓶中，并加水稀釋定容。然后精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水2 mL，然后再加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40 °C水浴中加熱15min，取出置冷水中冷卻20min，同時(shí)用2.0 mL蒸餾水做空白，用分光光度計(jì)在波長490 nm處測定吸光度。多糖提取率計(jì)算方法：

2.3 單因素考察

2.3.1 超聲功率對APS 提取的影響

在液料比(30∶1)和提取時(shí)間(30min)不變的情況下，設(shè)定不同功率的超聲強(qiáng)度(200，400，600，800，1 000 W)，分別進(jìn)行APS多糖的提取，然后測定多糖提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲強(qiáng)度對黃芪多糖得率的影響

從結(jié)果可以看出，多糖得率最大的提取功率是600 W ；在600 W以下時(shí)，多糖得率隨著超聲強(qiáng)度的增加而增大，當(dāng)功率大于600 W 時(shí)，多糖得率隨著功率的增加反而有降低的趨勢，這與大多數(shù)多糖提取工藝研究結(jié)果一致。原因可能在于多糖糖鏈在高強(qiáng)度(大于600 W)超聲條件下遭到破壞，乙醇沉淀多糖時(shí)，小分子量的多糖不能得以回收，造成損失，另一方面可能在于，多糖與蛋白結(jié)合為團(tuán)狀或球體，在超聲的作用下，多糖-蛋白復(fù)合體解聚，造成粗多糖的得率下降。

2.3.2 超聲時(shí)間對APS 提取率的影響

在液料比(30∶1)和超聲強(qiáng)度(600 W)不變的情形下，分別設(shè)置不同的提取時(shí)間(10, 20, 30 , 40, 50, 60min)，按照實(shí)驗(yàn)步驟提取黃芪多糖，并分別測定其提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，提取時(shí)間是影響多糖提取得率的一個(gè)非常重要因素，大多數(shù)植物多糖隨提取時(shí)間的增加，多糖得率會明顯增加，但也有部分容易降解的多糖會隨時(shí)間的增加導(dǎo)致分子鏈斷裂，從而導(dǎo)致得率下降，本實(shí)驗(yàn)中APS多糖的提取率隨提取時(shí)間的增加，得率明顯提高，當(dāng)提取時(shí)間在40min 時(shí)，多糖提取率增加不甚顯著。因此，可以用40min 作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的時(shí)間中心點(diǎn)，考察時(shí)間在提取過程中的作用。

2.3.3 液料比對APS 提取率的影響

在超聲強(qiáng)度(600 W)和提取時(shí)間(40min)不變的情形下，分別設(shè)置不同比例的液料比(20∶1, 30∶1, 40∶1, 50∶1, 60∶1)，依照實(shí)驗(yàn)步驟提取APS多糖，并測定多糖得率，結(jié)果見圖3。

植物中多糖類成分多數(shù)分布在植物細(xì)胞內(nèi)部，受細(xì)胞壁的影響，提取溶劑需滲透植物細(xì)胞內(nèi)部溶解多糖，通過擴(kuò)散作用得于分離。因此，提取過程中的水量是影響多糖得率的重要因素。從結(jié)果圖3可以看出，液料比低于30∶1時(shí)，多糖得率隨著液料比的增加而升高，液料比高于30∶1時(shí)，粗多糖得率略有增加，但增加不再顯著，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，擬設(shè)定30∶1作為響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3.4 提取次數(shù)對APS 得率的影響[7]

超聲強(qiáng)度設(shè)定為600 W， 提取時(shí)間設(shè)定為40min，液料比為30∶1，考察提取次數(shù)對多糖得率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 提取次數(shù)對黃芪多糖得率的影響

從圖4提取次數(shù)對多糖得率的影響可以看出，提取2 次以后多糖增加僅0.1% 左右，因此，響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)提取次數(shù)設(shè)為2 次。但從經(jīng)濟(jì)和耗能方面考慮，建議生產(chǎn)過程中提取次數(shù)設(shè)定為1 次。

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化APS多糖提取工藝的研究

根據(jù)Box Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以及綜合單因素影響多糖提取率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可選取對多糖提取率有較顯著影響的3個(gè)因素即超聲功率、時(shí)間和料液比，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)的方案，響應(yīng)面分析因素與水平見表1。對超聲功率X1、提取時(shí)間X2和料液比比X3各水平采用以下公式編碼：

即χ1=(X1-600)/200，χ2=(X2-40)/10，χ3=( X3-30)/10，以X1，X2，X3為自變量，以粗多糖提取率Y為響應(yīng)值，響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得APS多糖提取率對編碼自變量超聲功率、提取時(shí)間、料液比的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=6.78+0.35X1+0.16X2+ 0.27X3- 0.065X1X2-0.078X1X3-0.0014X2X3-0.47X12-0.28X22-0.18X32

回歸方程中各變量對指標(biāo)(響應(yīng)值)影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判定，概率P( F > Fα) 的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3可以看出，超聲功率，提取時(shí)間，料液比在APS多糖提取過程中影響顯著，其中超聲功率在多糖得率中起著主要作用，超聲功率與提取時(shí)間(X1X2)，超聲功率與料液比(X1X3)交互作用顯著?；貧w方程是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=99. 7% , 說明響應(yīng)值(提取率) 的變化有99. 7%來源于所選變量，即超聲功率、提取時(shí)間和料液比。

表3 回歸分析結(jié)果

2.5 響應(yīng)面圖及個(gè)因素交互關(guān)系

圖5 超聲功率、提取時(shí)間以及料液比對APS多糖得率的響應(yīng)面圖

從圖5 (A、B)可以看出，在超聲強(qiáng)度恒定的情況下，黃芪多糖收得率隨提取時(shí)間變化而發(fā)生相應(yīng)的變化，提取時(shí)間在40min時(shí)其收得率明顯提高；而當(dāng)固定提取時(shí)間時(shí)，多糖得率隨超聲強(qiáng)度的增大明顯提高。但提高的趨勢較超聲強(qiáng)度的影響弱，說明超聲強(qiáng)度在提取過程中占主導(dǎo)作用。超聲功率與料液比的相互作用見圖5 (C、D)，從圖中可以很明顯的看出超聲強(qiáng)度對多糖得率的影響顯著，這和表3 分析得到的結(jié)果一致。提取時(shí)間與料液比的交互作用圖見圖5 (E、F)，可以看出，可以看出提取時(shí)間和料液比對多糖得率的影響都較為顯著。固定一個(gè)因素，多糖得率隨另一個(gè)變量的增大而增加。

2.6 模型驗(yàn)證

根據(jù)2.2.1結(jié)果，響應(yīng)面給出的多糖得率最優(yōu)方案為：超聲功率 599.90 W，提取時(shí)間 46.06min，料液比 34.95 mL/g，預(yù)測得率為3.117%。為了操作簡便，方案修訂為超聲功率 600 W，提取時(shí)間 46min，料液比 35 mL/g，實(shí)驗(yàn)多糖得率為3.134%。與預(yù)測值接近，驗(yàn)證了模型的正確性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素考察，驗(yàn)證了影響黃芪多糖提取的主要因素有：提取時(shí)間、超聲功率、料液比。并選取中心組合實(shí)驗(yàn)的范圍和水平，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對各因素的最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行了研究和探討，建立了影響黃芪多糖提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，依據(jù)回歸分析結(jié)果，得出超聲提取黃芪多糖的最佳工藝條件為：超聲功率600 W，提取時(shí)間46min和料液比 35∶1，多糖得率為 3.134 %。該方法與傳統(tǒng)水提法相比，可以縮短提取時(shí)間，降低提取溫度，提高提取效率。實(shí)驗(yàn)證明，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化APS多糖的超聲波提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1]陳蔚，俞茂華，葉紅英，等．黃芪多糖保護(hù)糖尿病心肌的初步研究[J]．復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，34 (4)：541-544.

[2]蔡莉，朱江．黃芪多糖研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床，2007，34 (15)：896-900

[3]賀珍俊，那日蘇．黃芪多糖提取工藝研究綜述[J]．內(nèi)蒙古石油化工, 2003，29：5-6．

[4]黃禎．黃芪多糖的藥理研究進(jìn)展[J].中國臨床藥學(xué)雜志．2002．11(5)：31-35．

[5]李亞娜，林永成，余志剛．響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝[J]．華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，32 (11)：28.

[6]張惟杰．糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].2版．杭州：浙江大學(xué)出版社，2003：12-13．

[7]劉永錄,于 瑞,張國祖pH值對堿法提取黃芪多糖收率的影響及黃芪多糖體外抑茵作用研究[J],河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,(5)：117-119.

UltrasonicExtractionProcesswithResponseSurfaceOptimizationonAstragalusPolysaccharides

LIXiao-fang1,WURong2,YEXi-de3*

1.JiangxiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006; 2.JiangxiYuganCountyPeople'sHospital.Yugan335100; 3.GuangzhouUniversityOfChineseMedicine,Guangzhou510006;

Objective:To confirm the optimum technological conditions of Astragalus polysaccharides (APS) composition of ultrasonic extraction auxiliary. Method： APS content was determined by using phenol hydrate-sulfuric method, the regression model was gotten by using the response surface method on the main process parameters optimization,which ensured the extraction technology. Result：The optimum process conditions, ultrasonic power 600W, extracting time 46 min and liquid materials than 35∶1 plead,the rate of APS 3.134%, The relative error was non-attendance 1% between the regression model and the reality measured value, the fitting between the regression equation and the actual situation was good. Conclusion：The method is relatively economic and scientific.

Astragalus Polysaccharides; Extraction; Response Surface Method.

李曉芳，女，學(xué)士，主管中藥師，主要從事中藥成分研究。

**通訊作者：葉喜德，男，講師，廣州中醫(yī)藥大學(xué)在讀博士研究生，主要從事中藥延緩腦衰老研究。

R 283.6

A

2013-06-15)