山胡椒提取物的抑菌活性及其穩(wěn)定性*

游玉明，黃琳琳

(重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶 永川，402160)

山胡椒(Litsea cubeba)，又稱山蒼子、木姜子、山雞椒，為樟科(Lauraceae)木姜子屬多年生落葉小喬木，廣泛分布于亞洲熱帶，亞熱帶及澳洲等地，在我國多分布于長江流域以南各?。?－2］。據(jù)研究山胡椒果實中含有豐富的揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、γ-丁內(nèi)酯類及半萜類化合物，具有廣譜抗菌、溫中理氣、消腫止痛等多方面功效，是我國衛(wèi)生部公布的藥食兼用植物材料，有較高的食用及藥用價值［3－5］。目前，國內(nèi)外對山胡椒的研究主要集中在山胡椒精油的提取、化學成分分析及其生物活性等方面［6－9］，而對山胡椒提取物抑菌活性方面的研究鮮有報道?，F(xiàn)代食品工業(yè)中使用的防腐劑大多是化學防腐劑，由于化學防腐劑的安全性問題，開發(fā)植物天然防腐劑是目前食品防腐研究的熱點。因此，本實驗探討了山胡椒提取物對常見食品腐敗菌的抑制作用及其影響因素，以期為山胡椒的綜合利用及新型安全天然食品防腐劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山胡椒，采摘于重慶市開縣趙家街道漁樂基地，自然條件下陰干;乙酸乙酯、無水乙醇(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

供試菌種:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、熒光假單孢菌(P.Fluorescens)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，由西南大學食品科學學院實驗中心提供。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于細菌培養(yǎng);馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，用于酵母菌培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;SPX-250B-II 型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;LDZX-40AL 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;RE-301 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山胡椒不同溶劑提取物的制備

參照楊冬梅［10］的方法并做修改。將干燥的山胡椒粉碎過55 目篩，稱取山胡椒粉10 g，按1∶10 的固液比分別加3 種提取溶劑(水、75%乙醇溶液、乙酸乙酯)混合，在40℃恒溫搖床(140 r/min)中浸提4h，抽濾得到提取液，于55℃條件下減壓干燥至膏狀。實驗前將3 種提取物稀釋成2 g/mL(每1 mL 溶液中所含的有效成分來源于2 g 山胡椒粉)。

1.3.2 山胡椒提取物抑菌效果的測定

采用濾紙片法［11］。將滅菌后的濾紙片(直徑6 mm)分別放入3 種山胡椒提取物中浸泡30 min，取出晾干，備用。吸取100 μL 菌懸液(106～107個/mL)于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上涂布均勻，用無菌鑷子取含山胡椒提取物的濾紙片貼在固體平板上，每皿貼3 片，同時作對照。細菌37℃培養(yǎng)24 h，酵母菌28℃培養(yǎng)48 h 后觀察，測定濾紙片的抑菌圈直徑，結(jié)果取3 次實驗的平均值。

1.3.3 最低抑菌濃度( MIC) 的確定

采用兩倍稀釋法［12］。分別以75%乙醇和乙酸乙酯為溶劑，將山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物分別配制成一系列濃度梯度的溶液，加入已融化好的培養(yǎng)基中，混合均勻，使培養(yǎng)液中提取物質(zhì)量濃度分別為1、1/2、1/4、1/8、1/16。待培養(yǎng)基凝固后，分別接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌及釀酒酵母，培養(yǎng)后觀察。以肉眼無可見菌落生長的最小質(zhì)量濃度為其MIC，以相應(yīng)溶劑作對照。

1.3.4 山胡椒提取物的抑菌穩(wěn)定性

1.3.4.1 熱處理對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

取10 mL 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物于25 mL 具塞比色管中，分別置于80、100℃水浴和121℃濕熱條件下處理30 min，用濾紙片法測定樣品抑菌圈直徑，實驗重復(fù)3 次。

1.3.4.2 pH 對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

用0.1 mol/L 的NaOH 和0.1 mol/L 的HCl 分別將75%乙醇及乙酸乙酯提取液的pH 值調(diào)為3、5、7、9、11，用濾紙片法測定樣品抑菌圈直徑，實驗重復(fù)3次。

1.3.4.3 紫外照射對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

取10 mL 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物于25 mL 具塞比色管中，置于20 W 的紫外燈下30 cm處分別照射10、30、60 min，用濾紙片法測定樣品抑菌圈直徑，實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 山胡椒不同溶劑提取物的抑菌效果

由表1 可以看出，山胡椒不同溶劑提取物對供試菌抑菌能力不同，其中乙酸乙酯提取物對5 種供試菌的抑制效果最好，其對5 種供試菌的抑制效果按照抑菌圈直徑由大到小的順序為:枯草芽孢桿菌(14.3 mm)＞熒光假單胞菌(12.9 mm)＞金黃色葡萄球菌(12.0 mm)＞釀酒酵母(10.9 mm)＞大腸桿菌(6.5 mm)。其次是75%乙醇提取物，其對熒光假單胞菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為11.1 mm，說明山胡椒提取物對微生物的抑制作用具有選擇性。而山胡椒水提取在每1 mL 溶液中所含有效成分來源于2 g山胡椒粉的濃度下，對5 種微生物的抑菌圈直徑均為濾紙片直徑(6.0 mm)，即均沒有抑制效果。這可能是因為山胡椒中的主要有效成分如精油、生物堿及萜類等化合物為極性較弱的物質(zhì)，在水中溶解度較小，而在75%乙醇及乙酸乙酯這兩種提取溶劑中的溶解度較大。

表1 山胡椒不同溶劑提取物的抑菌效果Table 1 Inhibition zone diameters of different extracts from Litsea cubeba

2.2 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物的MIC

根據(jù)實驗結(jié)果選擇研究山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物的MIC，采用2 倍稀釋法進行測定。由表2 可知，山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物對不同供試菌具有不同的抑菌效果，2 種提取物均對熒光假單胞菌的抑制效果最好，MIC 為1/32 g/mL;其次為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，MIC 為1/16 g/mL;而對釀酒酵母，乙酸乙酯提取物有較好的抑菌效果，其MIC 為1/16 g/mL。

表2 山胡椒75%乙醇及乙酸乙酯提取物MICTable 2 MICs of 60% ethanol and ethyl acetate extracts from Litsea cubeba

2.3 山胡椒提取物的抑菌穩(wěn)定性

2.3.1 熱處理對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

熱處理對提取物抑菌活性的影響見圖1。由圖1可知，山胡椒提取物經(jīng)不同溫度熱處理后仍保持較強的抑菌活性，在處理溫度不超過100℃時，與空白對照相比均沒有顯著性差異(P＞0.05)，即使在121℃處理30 min 后，除75%乙醇提取物對熒光假單胞菌和乙酸乙酯提取物對釀酒酵母的抑菌性顯著性(P＜0.05)下降之外，對其他供試菌仍具有較高的活性，說明了山胡椒中的抑菌成分具有較好的熱穩(wěn)定性，與顧仁勇等［2］對山胡椒精油抑菌穩(wěn)定性的研究結(jié)論一致。

2.3.2 pH 對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

圖1 熱處理對山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 1 Effect of heat treatment on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

pH 對提取物抑菌活性的影響見圖2。由圖2 可以看出，pH 值對山胡椒提取物抑菌活性有一定影響。當pH ＜7 時，隨著pH 值的增加，抑菌性呈現(xiàn)增加的趨勢，當pH ＞7 時，山胡椒75%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌性活性顯著(P＜0.05)下降;山胡椒乙酸乙酯提取物在pH ＞9 之后對釀酒酵母抑菌活性基本消失，而2 種提取物對枯草芽孢桿菌及熒光假單胞菌的抑制能力隨pH 值的升高而增加，這可能是因為山胡椒提取物中存在黃酮類等部分酸性抑菌成分和生物堿等堿性抑菌成分［13］，與溶液中的酸堿物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，喪失了對部分微生物的抑制作用。因此總體來看，山胡椒提取物在pH 值5 ～7時抑菌活性較強。

2.3.3 紫外照射對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響

紫外照射對提取物抑菌穩(wěn)定性的影響見圖3。從圖3 可知，紫外線照射對山胡椒提取物抑菌活性有較大的影響，但2 種提取物中的抑菌成分對紫外線的敏感性存在一定差異。75%乙醇提取物在經(jīng)紫外線照射30 min 后，對4 種供試菌的抑菌能力基本保持不變，但乙酸乙酯提取物僅在紫外照射10 min 后能保持較強的抑菌活性，當經(jīng)紫外照射30 min 后，與對照相比其抑菌活性顯著性(P＜0.05)下降;2 種山胡椒提取物抑菌能力經(jīng)紫外照射60 min 后均顯著性下降(P＜0.05)，對釀酒酵母基本失去了抑制能力。這說明山胡椒抑菌物質(zhì)中含有部分對紫外線敏感的抑菌成分，長時間紫外照射，對山胡椒提取物抑菌能力有較大的破壞。因此，在實際應(yīng)用中應(yīng)盡量縮短紫外照射時間。

圖2 pH 對山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 2 Effect of pH on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

圖3 紫外照射對山胡椒提取物抑菌穩(wěn)定性的影響Fig 3 Effect of UV irradiation on antimicrobial activity of extract from Litsea cubeba

3 結(jié)論

山胡椒75%乙醇提取物及乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌、熒光假單胞菌及釀酒酵母等5 種供試菌均有一定的抑制作用，3 種提取物抑菌效果大小順序為:乙酸乙酯提取物＞75%乙醇提取物＞水提物。MIC 實驗表明，山胡椒提取物對不同菌種的抑制作用差別較大，其中抑制熒光假單孢菌的MIC 值最小，為1/32 g/mL。穩(wěn)定性實驗表明，pH 值及紫外照射對山胡椒75%乙醇提取物及乙酸乙酯提取物的抑菌能力有一定影響，在pH 值為5 ～7 時對5 種供試菌的抑菌效果較好，但對紫外線的敏感性存在一定差異，75%乙醇提取物經(jīng)紫外照射30 min 后，其抑菌能力顯著下降(P＜0.05)，而乙酸乙酯提取物僅經(jīng)紫外照射10 min，則顯著性降低(P＜0.05)。2 種提取物熱穩(wěn)定良好，即使在121℃處理30 min 仍能保持較強抑菌能力。

本文主要考察了山胡椒提取物的抑菌活性及其穩(wěn)定性，但其中發(fā)揮主要抑菌活性的物質(zhì)組成還未能明確，下一步將進行其主要抑菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析，從而明確抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)及機理。

［1］ 陳學恒. 我國山蒼子資源利用現(xiàn)狀和產(chǎn)業(yè)化前景評述［J］． 林業(yè)科學，2003，39(4):134 －139.

［2］ 顧仁勇，劉寶瑩. 山蒼子精油抑菌及抗氧化作用的研究［J］． 食品科學，2008，27(11):86 －89.

［3］ 趙利琴. 山胡椒屬萜類及其生物活性研究進展［J］． 時珍國醫(yī)國藥，2006，17(2):171 －174.

［4］ Chen Chi-Jung，Yen-Hsueh Tseng，Chu Fang-Hua，et al.Neuropharmacological activities of fruit essential oil from Litsea cubeba Persoon［J］． J Wood Sci，2012，58(6):538 －543.

［5］ Yueh-Te Chang，Chu Fang-Hua，et al. Molecular cloning and characterization of monoterpene synthases from Litsea cubeba (Lour.)Persoon［J］． Tree Genetics ＆ Genomes ，2011，7(4):835 －844.

［6］ 張小云，覃文慶，喻連香. 山胡椒揮發(fā)油的提取及其抑菌活性研究［J］． 現(xiàn)代生物醫(yī)學研究進展，2010，10(1):133 －136.

［7］ 范東翠，鄧曉雯. 山蒼子抗氧化性研究［J］． 食品工業(yè)科技，2009，30(8):73 －75.

［8］ 游玉明，顏士英. 山胡椒果實揮發(fā)油化學成分的GCMS 分析［J］． 食品研究與開發(fā)，2013，34(8):81 －83.

［9］ Wang Ying，Jiang Zi-tao，Li Rong. Complexation and molecular microcapsules of Litsea cubeba essential oil with βcyclodextrin and its derivatives［J］． Eur Food Res Technol，2009，228(6):865 －873.

［10］ 楊冬梅，朱興一，王秋霜，等. 蕨麻提取物的抑菌作用及其穩(wěn)定性研究［J］． 食品科學，2010，31(7):127－130.

［11］ 陳敬華，胡準，鄭化，等. 長君竹蓀提取物化學組成及抑菌活性的研究［J］． 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，(24):905 －909.

［12］ 張桂霞，齊敬浩，任旭，等. 白刺果實提取物的體外抑菌活性研究［J］． 食品工業(yè)科技，2012，33(13):104 －106.

［13］ 王然，唐生安，翟慧媛，等. 山胡椒抗腫瘤轉(zhuǎn)移化學成分研究［J］． 中國中藥雜志，2011，36(8):1 032 －1 036.