葛花粉體高效球磨制備技術(shù)及其醒酒活性測(cè)定*

許陽，杜先鋒，王一見

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥，230036)

葛花是古方解酒良藥［1］，其主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜皂苷類、香豆素類、甾醇類、揮發(fā)油、生物堿和人體不能合成的必需氨基酸和無機(jī)鹽。日本學(xué)者金城順英指出，葛花中含有的皂角苷和異黃酮可以改善酒精對(duì)人體造成的新陳代謝異常［2］，從而起到解酒醒酒的作用。而葛花含有18 種異黃酮類化合物［3］，目前國(guó)內(nèi)研究均注重于其中功能成分的提取和分離，但隨著目前飲酒、酗酒群體日益激增，對(duì)高效迅速的醒酒措施需求加大，而采用傳統(tǒng)煎煮的用藥方式可能會(huì)導(dǎo)致藥液中物質(zhì)發(fā)生絡(luò)合、水解、氧化等反應(yīng)，使功效減弱，以單一某種功能成分為目標(biāo)進(jìn)行提取優(yōu)化則會(huì)導(dǎo)致其他有效組分的大量丟失，且增加成本投入，不利于資源綜合利用。本實(shí)驗(yàn)旨在探究采用高效球磨技術(shù)將葛花進(jìn)行精細(xì)粉碎，進(jìn)而增大表面電能及其與介質(zhì)的接觸面積，最大程度保留其中的功能因子，提高植物細(xì)胞中初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的溶出速率和溶出量。

本文將采用高效球磨技術(shù)制備葛花粉體與傳統(tǒng)粉碎方法制備的粉體進(jìn)行比較，采用瓦勒-赫霍法并稍加改良后，通過體外測(cè)定ADH 活性［4］，考察葛花粉體對(duì)ADH 活性的影響。

1 材料與儀器

1.1 原輔材料

葛花，安徽省霍山縣黃何葛業(yè)有限公司。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所;氧化型輔酶I(NAD+)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;乙醇脫氫酶(ADH)，Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

高效球磨機(jī)結(jié)構(gòu)如圖1 所示，罐體通過彈簧伸縮變化而進(jìn)行快速多維擺動(dòng)式運(yùn)動(dòng)，使物料在罐內(nèi)不規(guī)則運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生巨大的沖擊力，延長(zhǎng)物料的運(yùn)動(dòng)軌跡、提高沖擊能、減少撞擊盲點(diǎn)，顯著提高罐內(nèi)磨介的沖擊能量和運(yùn)動(dòng)次數(shù)，提高了被粉碎顆粒的均勻度。與此同時(shí)，為避免罐體迅速升溫而導(dǎo)致物料性狀發(fā)生改變，采用罐體夾套循環(huán)水進(jìn)行冷卻降溫。

圖1 高效球磨機(jī)示意圖Fig.1 Schematic diagram of high efficient ball mill

1.4 儀器

unicUV-2102C 型紫外分光光度計(jì);PB-10 Sartorius 精密pH 計(jì);Konica CM-3500d 臺(tái)式色差儀;Mastersizer2000 激光粒度分析儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 植物樣品的制備

將葛花洗凈、晾干，60 ℃烘干2 h，置于干燥器內(nèi)備用。

取一定量的葛花原料，用HX-200A 型高速中藥粉碎機(jī)粉碎，取100 ～150 目篩之間為葛花的常規(guī)粉體。常規(guī)粉體再經(jīng)超微粉碎后，取200 ～300 目篩之間粉體為Ⅰ級(jí)粉體。再取Ⅰ級(jí)粉體經(jīng)高效球磨機(jī)得到Ⅱ級(jí)粉體。

2.2 激光粒度分布測(cè)試

以空氣為分散介質(zhì)，經(jīng)Mastersizer2000 激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑分析。

2.3 總?cè)艹龆鹊臏y(cè)定

精密稱取葛花、常規(guī)粉體、Ⅰ級(jí)粉體、Ⅱ級(jí)粉體各5．000 0 g 于錐形瓶中，加入純水150 mL，置于(37 ±1)℃水浴加熱，分別于1、3、5、10、20、30、60 min 后過濾，取50 mL 濾液于已知恒重的鋁制稱量皿中，90℃水浴蒸干后擦去器皿外壁水分，放入(100 ±2)℃烘箱干燥1 h 后于室溫冷卻30 min，反復(fù)干燥冷卻操作，保證最后2 次重量之差小于2 mg，準(zhǔn)確稱重(恒重)，以干燥后的恒重與稱量皿自重的差值表示總物質(zhì)溶出度。每組設(shè)3 次平行樣，計(jì)算結(jié)果取平均值。

2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 衍生體系方法［8］。

準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用80%乙醇溶解，配制成0．2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分別置于10 mL 比色管中，用80%乙醇補(bǔ)至5.0 mL，加入0.3 mL5%NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min 后加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻，靜置6 min 后再加入4.0 mL 4%NaOH 溶液，搖勻后純水定容至刻度線，混合均勻，于80 ℃水浴靜置10 min，冷卻至室溫后于506 nm 測(cè)定吸光度?；貧w方程為Y=7.02X﹣0.019 8(X為蘆丁標(biāo)品在506 nm 下的OD值)，R2=0.999 1。

2.5 總黃酮溶出量的測(cè)定

精密稱取葛花、常規(guī)粉體、Ⅰ級(jí)粉體、Ⅱ級(jí)粉體各5.0 g 于錐形瓶中，加純水150 mL 置于(37 ±1)℃水浴加熱60 min 后，過濾，取濾液2.0 mL 置于10 mL比色管中，用80%乙醇補(bǔ)至5.0 mL 后，按2.4 所述方法依次加入反應(yīng)試劑，以不加Al(NO3)3溶液為空白對(duì)照進(jìn)行測(cè)定。以80%乙醇85 ℃水浴條件下回流浸提3 次測(cè)得的總黃酮溶出量為指標(biāo)考察4 種不同方法處理得到的葛花粉體對(duì)其中總黃酮溶出量的影響。

式中:c，葛花溶液總黃酮濃度(mg/mL);V，待測(cè)提取液的體積(mL);m，葛花粉體質(zhì)量(g)。

2.6 不同粉體溶液色度差的測(cè)定

溶液顏色的比較使用Konica CM-3500d 進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)測(cè)定得出的數(shù)據(jù)(L*、a*、b*)對(duì)4 種不同粉體溶液色差進(jìn)行分析比較。

2.7 乙醇脫氫酶(ADH)活力的測(cè)定

稱取10.0 g 各級(jí)粉體于溶于150 mL 純水中，于37 ℃水浴加熱90 min，取濾液50 mL，采用瓦勒-赫霍法，并稍加改良測(cè)定ADH 活力。取pH = 8.8 的Na4P2O7溶液1.5 mL 于比色管中，加入27 mmol/L 輔酶溶液(NAD+)1.0 mL，11.5%乙醇溶液0.5 mL，樣品溶液0.1 mL，混合后，于25 ℃水浴中加蓋育溫5 min 后立即加入ADH 溶液0.1 mL，混合搖勻后每隔10 s 立即測(cè)定λ =340 nm 時(shí)的吸光值，連續(xù)測(cè)定5 min。以純水代替乙醇作為參比調(diào)零，以純水代替樣品溶液測(cè)定對(duì)照組ADH 酶活。

以A340對(duì)時(shí)間作圖，取反應(yīng)最初線性部分，計(jì)算A340/10 s 的增加值，根據(jù)NADH 的摩爾吸光系數(shù)κ=6．2 ×103［L/(mol·cm)］計(jì)算ADH 酶活。公式如下:

3 結(jié)果與分析

3.1 葛花Ⅱ級(jí)粉體粒度分析

由于實(shí)際顆粒的形狀通常為非球形的，難以直接用直徑表示其大小，因此在顆粒粒度測(cè)試領(lǐng)域，對(duì)非球形顆粒，通常以等效粒徑來表征顆粒的粒徑。如圖2 所示，激光粒度分析儀測(cè)得葛花Ⅱ級(jí)粉體粒度分布基本呈正態(tài)分布趨勢(shì)，葛花粉體粒徑范圍在4.25 ～43.74 μm，中值粒徑d(0.5)為8.08 μm，大多數(shù)高等植物細(xì)胞的直徑通常約在10 ～200 μm，可見經(jīng)過高效球磨技術(shù)處理的葛花粉末已基本達(dá)到細(xì)胞破碎的水平，更有利于其胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放。

3.2 葛花粉體特性對(duì)比實(shí)驗(yàn)

3.2.1 總物質(zhì)溶出度比較

圖2 葛花Ⅱ級(jí)粉體粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of second grade of Flos puerariae

不同粉碎級(jí)別粉體總?cè)艹龆鹊臏y(cè)定結(jié)果見表1。表1 結(jié)果表明，各粉體的溶出度隨水浴加熱時(shí)間增加而逐漸提高，其中葛花Ⅱ級(jí)粉體均在瞬時(shí)溶出度(1 min)及后續(xù)時(shí)間段高于其他組別，葛花Ⅱ級(jí)粉體(0.182 49 g)比未處理的植物本體(0.021 45 g)高出8.6 倍，葛花Ⅱ級(jí)粉體的溶出度在20 min 后其速率趨于平緩，但較其余組別仍一直保持較高溶出量。

3.2.2 總黃酮溶出量比較

功能性因子黃酮主要存在于植物體細(xì)胞中，由纖維素和果膠構(gòu)成的堅(jiān)韌細(xì)胞壁會(huì)阻礙黃酮的溶出，影響其利用度。由圖3 可以看出，隨著植物粉體粒徑的不斷減小，在同溫同體積下浸提得到的黃酮，其溶出量存在明顯變化，由未處理葛花本體的2.67 mg/g 升高至Ⅱ級(jí)粉體的9.75 mg/g，與80%乙醇提取3 次得到的黃酮溶出量12.21 mg/g 比較，Ⅱ級(jí)粉體黃酮溶出含量提高57.98%。可見采用高效球磨技術(shù)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，可使絕大多數(shù)的功能性成分在短時(shí)間內(nèi)充分溶解于介質(zhì)當(dāng)中，最大程度提高其生物利用度。

表1 葛花不同粒徑粉體對(duì)總物質(zhì)溶出度的影響Table 1 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on total material dissolution

圖3 葛花不同粒徑粉體對(duì)總黃酮溶出量的影響Fig.3 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on flavone dissolution

3.2.3 葛花不同粒徑粉體溶液色度差的比較

L*是色彩的明度值，其范圍從0 到100，值為0時(shí)亮度最低，為100 時(shí)亮度最高。a*、b*值是色彩的色度值，其中a*值從紅(正值)到綠(負(fù)值)漸變，b*值則是由黃(正值)到藍(lán)(負(fù)值)漸變。

由表2 可知雖然未處理葛花溶液的亮度最高，但是色度值均低于其他組，而由葛花Ⅱ級(jí)粉體制備的溶液色度值最高，溶液的顏色最深，但是亮度卻比常規(guī)粉體和I 級(jí)粉體清亮。由3.2.1 及3.2.2 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知葛花Ⅱ級(jí)粉體單位時(shí)間內(nèi)的釋放量及其功能因子的溶出度最好，以其溶液色度參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算總色差，結(jié)果表明未處理的溶液顏色與標(biāo)準(zhǔn)樣差別最大，其次是常規(guī)粉體，I 級(jí)粉體溶液與標(biāo)準(zhǔn)樣最為接近，結(jié)合上述Ⅱ級(jí)粉體溶液較其他組別在總?cè)艹龆群忘S酮溶出量上有明顯差異的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在該色度差實(shí)驗(yàn)中通過a*、b*值的變化得到進(jìn)一步補(bǔ)充說明，但L*值并不隨趨勢(shì)減小，較常規(guī)粉體和Ⅰ級(jí)粉體的溶液L*值反而變大，溶液更為清亮，這提示該結(jié)果可能與采用球磨機(jī)制得Ⅱ級(jí)粉體其獨(dú)特的破壁結(jié)構(gòu)和粒徑特性有關(guān)。

3.3 乙醇脫氫酶(ADH)活力的測(cè)定

乙醇進(jìn)入機(jī)體后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)乙醇脫氫酶(ADH)氧化成乙醛，此過程是乙醇代謝的第一關(guān)卡，會(huì)消耗大量的輔酶Ⅰ(NAD+)，長(zhǎng)期過量飲酒或一次大量飲酒會(huì)導(dǎo)致ADH 活性降低［9］，根據(jù)產(chǎn)物DADH在340 nm 處有最大吸收，且這種變化速率與ADH 活力存在一定線性關(guān)系來計(jì)算葛花不同粒徑粉體對(duì)ADH 活性的影響。

表2 不同溶液色度差的分析結(jié)果Table 2 Analysis results of colour aberrations on different solutions

測(cè)定結(jié)果見表3，比較植物經(jīng)過不同粉碎處理后對(duì)ADH 活性的影響，發(fā)現(xiàn)Ⅱ級(jí)粉體均對(duì)ADH 激活率最高，其次是Ⅰ級(jí)粉體、常規(guī)粉體，對(duì)ADH 激活率最低的是不做任何處理的傳統(tǒng)植物本身，說明通過高效球磨技術(shù)處理后的植物粉體能在短時(shí)間內(nèi)快速促進(jìn)其功效的發(fā)揮，迅速提高ADH 的活性。

表3 葛花不同粒徑粉體對(duì)ADH 活性的影響Table 3 Effect of different particle sizes of Flos Puerariae on the activity of ADH

4 結(jié)論

通過比較葛花不同粒徑粉體的系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，若采用傳統(tǒng)直接煎煮方法獲得功能成分和功效最不理想，而采用球磨技術(shù)制備的Ⅱ級(jí)粉體中值粒徑為8.08 μm(根據(jù)目數(shù)與粒徑的對(duì)應(yīng)關(guān)系10 μm 對(duì)應(yīng)目數(shù)為1 340 目，則8.08 μm 對(duì)應(yīng)目數(shù)超過1 340目)，且粉體粉碎度均勻，也無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，達(dá)到細(xì)胞級(jí)粉碎破壁水平，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物中總?cè)艹龆取ⅫS酮溶出量的影響均與粉體粒徑度有直接關(guān)系，粉體粒度越小，溶出時(shí)間越短。乙醇脫氫酶活性的變化影響到血中乙醇的濃度，若該酶的活力下降則導(dǎo)致機(jī)體中可利用的乙醇含量增加，進(jìn)而加重乙醇對(duì)腦、肝臟等器官傷害作用。Yokoyama 指出ADH 在乙醇第一步的代謝中起到關(guān)鍵作用［11］，可以減少機(jī)體對(duì)乙醇的利用度，防止酒精性肝病的發(fā)生。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛花Ⅱ級(jí)粉體對(duì)ADH 的激活率最高，是未處理葛花激活率的2 倍，采用此高效球磨技術(shù)得到的超微粉體可達(dá)到有效成分溶出速度快、功效釋放迅速的目的。

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