軟棗獼猴桃多糖的免疫活性*

宣麗，劉長(zhǎng)江

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽(yáng) 遼寧，110866)

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta(Sieb. et Zucc. )Planch. ex Miq. )又名軟棗子、獼猴梨、藤梨，是獼猴桃科、獼猴桃屬多年生落葉藤本植物［1］。果實(shí)為翠綠色，表皮光滑無(wú)毛，具有很強(qiáng)的加工適應(yīng)性［2－3］。軟棗獼猴桃中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生物活性成分［4－7］。軟棗獼猴桃多糖具有降血糖降血脂的作用［8］，作者在前期試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)軟棗獼猴桃多糖具有一定的抗氧化活性，但關(guān)于其免疫調(diào)節(jié)活性鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬通過(guò)研究軟棗獼猴桃多糖純化組分對(duì)大鼠免疫功能的影響，確證該成分提高機(jī)體免疫力的功效成分，為軟棗獼猴桃的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試驗(yàn)動(dòng)物

軟棗獼猴桃鮮果，采自遼寧省沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)東北野生獼猴桃資源圃，該品種經(jīng)遼寧省種子管理局鑒定并進(jìn)行新品種備案，命名為長(zhǎng)江一號(hào)。

SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量180 ～200 g ，合格證號(hào)為SCXK(遼)2010 －0001，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。領(lǐng)回后飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán)境中，自由飲水進(jìn)食。

1.2 儀器與試劑

U-2910 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日立先端科技股份有限公司;Heto-LL3000 凍干機(jī)，賽默飛世爾科技公司;HC23B-AV 型微波爐，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;5805 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司;HEPA CLASS 100 CO2培養(yǎng)箱，Thermo Labsystems公司;Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek 公司;SA-1480-2 超凈無(wú)菌工作臺(tái)，上海上凈凈化設(shè)備有限公司;倒置顯微鏡，重慶光電儀器公司;96 孔培養(yǎng)板，Greiner 公司。

刀豆蛋白A(ConA)、噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma 公司;RPMI-1640 培養(yǎng)液，Gibco 公司;胎牛血清，Hyclone 公司;香菇多糖，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 軟棗獼猴桃多糖純品的制備

軟棗獼猴桃鮮果破碎后采用確定的乙醇除雜工藝:乙醇濃度80%、料液比1∶2(g/mL)、時(shí)間60 min，去除軟棗獼猴桃果中大量的色素類雜質(zhì)及還原糖，抽濾，棄去上清液，沉淀部分采用微波輔助提取工藝:料液比1∶9(g/mL)、微波處理時(shí)間10 min、微波功率500 W 進(jìn)行提取，提取結(jié)束后，離心獲得的上清液進(jìn)行減壓濃縮，然后用4 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，4℃冷藏12 h，沉淀離心后依次用石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇浸泡洗滌，抽濾后冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖粗品。

將軟棗獼猴桃多糖粗品復(fù)溶(5 mg/mL)，其水溶液經(jīng)DEAE-纖維素柱層析(D1.6 cm ×30 cm)，每次上樣10 mL，依次用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫，洗脫速度為1.25 mL/min，每管5 mL 分步收集，逐管檢測(cè)多糖含量(苯酚-硫酸法A490nm)，收集0.1 mol/L 鹽洗組分，透析脫鹽濃縮后經(jīng)SephadexG-100(D1.0 cm×40 cm)凝膠柱進(jìn)行純化。凝膠層析柱先用0.1 mol/L NaCl 溶液平衡48 h，再以0.1 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，每次上樣5mL，流速為0.5 mL/min，每管5 mL 分步收集，逐管檢測(cè)多糖含量(苯酚-硫酸法A490nm)，收集單一峰組分，透析脫鹽濃縮后，冷凍干燥，得軟棗獼猴桃多糖純品。

1.4 軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響

SD 雄性大鼠40 只，隨機(jī)分為5 組，即空白對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組［香菇多糖2 mg/(kg·d)］、多糖低劑量組［2mg/(kg·d)］、多糖中劑量組［10 mg/(kg·d)］和多糖高劑量組［20 mg/(kg·d)］，每組8 只，每只每日按相應(yīng)劑量灌胃1 次，連續(xù)給藥28 d。末次給藥30 min 后，大鼠稱重，按3 mL/kg 尾靜脈注射生理鹽水稀釋3 倍的印度墨汁，注入墨汁后2min 和10 min 分別從眼眶靜脈叢取血20 μL，并立即加到2mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Na2CO3溶液中，于波長(zhǎng)675 nm 處測(cè)定吸光值，以Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。最后將大鼠頸椎脫臼處死，分別稱取肝臟、脾臟、胸腺質(zhì)量。計(jì)算吞噬指數(shù)α 和免疫臟器指數(shù)［9］。

式中:A1和A2分別指注入墨汁后2 min 和10 min 取血測(cè)定的吸光值;t1為2 min;t2為10 min。

胸腺指數(shù)/% = 胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100

脾臟指數(shù)/% = 脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100

1.5 軟棗獼猴桃多糖對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

試驗(yàn)大鼠按1.4 節(jié)方法分組并給藥。

脾細(xì)胞懸液的制備:頸椎脫臼處死大鼠，75%酒精中浸泡消毒。無(wú)菌取大鼠脾臟，置于盛有適量無(wú)菌Hanks 液的平皿內(nèi)，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。經(jīng)200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，用Hanks 液洗2 次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液，細(xì)胞沉淀用適量RPMI-1640 完全培養(yǎng)液重懸，得單個(gè)脾細(xì)胞懸液。用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%，用RPMI-1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3 ×106個(gè)/mL。

將脾細(xì)胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，實(shí)驗(yàn)孔加入10 μL 100 μg/mL ConA，對(duì)照孔加入10 μL RPMI-1640 培養(yǎng)液，重復(fù)3 孔，置5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)68 h，加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入酸性異丙醇100 μL/孔，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm［10］。

轉(zhuǎn)化指數(shù)=實(shí)驗(yàn)孔A570nm－對(duì)照孔A570nm

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠免疫器官的影響

表1 列出不同劑量的軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響情況。與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、多糖低劑量組和多糖中劑量組大鼠的脾臟指數(shù)都有所升高，但無(wú)顯著性差異;多糖高劑量組大鼠的脾臟指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。

表1 軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響(x±s，n=8)Table 1 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on thymus index and splenetic index (x±s，n=8)

與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組大鼠的胸腺指數(shù)顯著升高(P＜0.05);多糖低劑量組大鼠的胸腺指數(shù)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異;多糖低、中劑量組與高劑量組之間差異顯著(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的胸腺指數(shù)與多糖高劑量組之間無(wú)顯著性差異。

2.2 軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠碳廓清能力的影響

軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，多糖低劑量組大鼠的吞噬指數(shù)略有升高，但無(wú)顯著性差異;陽(yáng)性對(duì)照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組的吞噬指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05);陽(yáng)性對(duì)照組的吞噬指數(shù)＞多糖高劑量組＞多糖中劑量組，但三者之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明軟棗獼猴桃多糖能顯著增強(qiáng)大鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，加速碳粒的清除。

表2 軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠碳廓清能力的影響(x±s，n=8)Table 2 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on carbon clearance capacity of rats (x±s，n=8)

2.3 軟棗獼猴桃多糖對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

表3 列出軟棗獼猴桃多糖對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響情況，陽(yáng)性對(duì)照組、多糖中劑量組和多糖高劑量組對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.01);但多糖低劑量組對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異;多糖高劑量組的轉(zhuǎn)化指數(shù)＞多糖中劑量組＞陽(yáng)性對(duì)照組，但三者之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明軟棗獼猴桃多糖對(duì)大鼠的脾淋巴細(xì)胞有直接促進(jìn)有絲分裂作用，可通過(guò)激活T 細(xì)胞增強(qiáng)大鼠的細(xì)胞免疫功能。

表3 軟棗獼猴桃多糖對(duì)ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(x±s，n=24)Table 3 Effect of Actinidia arguta polysaccharide on lymphocyte transformation in splenic cells induced by ConA (x±s，n=24)

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，10、20 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖均可顯著提高大鼠的胸腺指數(shù)、吞噬指數(shù)及ConA 誘導(dǎo)的大鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù);20 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖可顯著提高大鼠的脾臟指數(shù)。2 mg/(kg·d)劑量組軟棗獼猴桃多糖也可提高大鼠的臟器指數(shù)、吞噬指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)，但與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，表明隨著軟棗獼猴桃多糖劑量的增加，其免疫活性有所增強(qiáng)，但10 mg/(kg·d)和20 mg/(kg·d)劑量組之間對(duì)吞噬指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)的影響無(wú)顯著性差異，表明當(dāng)軟棗獼猴桃多糖達(dá)到一定劑量時(shí)，免疫活性與劑量之間的相關(guān)性減弱。上述研究結(jié)果表明，軟棗獼猴桃多糖是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，在醫(yī)藥和保健品等方面具有一定的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

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