化學(xué)交聯(lián)與酶法交聯(lián)對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜性質(zhì)的影響*

陶忠，鄭惠彬，翁武銀

(集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門，361021)

近年來(lái)，利用多糖、蛋白質(zhì)和脂類等天然高分子制備可降解/可食性包裝材料已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其中蛋白質(zhì)因具有良好的成膜性能和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而備受關(guān)注。另一方面，我國(guó)水產(chǎn)品年加工量已經(jīng)超過1 600 萬(wàn)t［1］，在魚糜生產(chǎn)和凍魚片加工中必然會(huì)產(chǎn)生大量魚皮、碎肉等下腳料。目前，這些下腳料主要是用于生產(chǎn)魚粉等低值產(chǎn)品，有些甚至直接被丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。

研究表明，魚肉蛋白和魚皮明膠都可以制備蛋白可食膜［2－3］，但蛋白質(zhì)中大量的親水性氨基酸會(huì)導(dǎo)致形成的可食膜的耐水性能較差。利用化學(xué)交聯(lián)劑和酶交聯(lián)劑不僅可以改善蛋白膜的機(jī)械性能，還可以提高膜的耐水性能［4－5］。其中，戊二醛由于價(jià)格低廉、交聯(lián)效率高，作為化學(xué)交聯(lián)劑已被應(yīng)用于明膠蛋白膜［3，6］、乳清分離蛋白膜［7］和大豆蛋白膜［8］的性質(zhì)改良。另一方面，相對(duì)于戊二醛的安全問題，酶交聯(lián)劑在食品中的應(yīng)用沒有受到嚴(yán)格控制。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase)作為常用的酶交聯(lián)劑可以提高大豆蛋白膜［5，9］、明膠蛋白膜［10］的機(jī)械性能和耐水性能。而且，隨著微生物發(fā)酵法生產(chǎn)TGase 的技術(shù)不斷成熟，利用TGase 改良可食膜的生產(chǎn)成本也逐漸下降［7］。然而有關(guān)利用戊二醛或TGase 改良魚糜-明膠復(fù)合膜的性質(zhì)目前鮮見報(bào)道。

因此，本研究利用戊二醛和TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜進(jìn)行性質(zhì)改良，比較化學(xué)交聯(lián)與酶法交聯(lián)對(duì)復(fù)合膜性質(zhì)的影響，旨在為利用交聯(lián)劑改良蛋白膜的性能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鰱魚魚糜(A 級(jí)，蛋白含量為16.8%，水分含量為78.1%)，福建安井食品有限公司;新鮮的白鰱魚魚皮，廈門同安源水水產(chǎn)食品有限公司;戊二醛溶液(AR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;TGase(酶活力100 ～120 U/g，食品級(jí))，南寧龐博生物工程有限公司;DC 蛋白測(cè)定試劑盒，美國(guó)Bio-Rad 公司;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-25 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司;FA25 高剪切分散乳化機(jī)，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;SPX 智能型恒溫恒濕箱，寧波萊?？萍加邢薰?厚度儀，日本Ozaki MFG 公司;TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)Food Technology 公司;UV-2600A 型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;WSC-S 測(cè)色色差計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;UM113 型攪拌脫泡機(jī)，日本Unix 有限公司;FT/IR-480 型傅里葉變換紅外光譜儀，日本JASCO 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白膜的制備

白鰱魚魚皮利用0.05 mol/L NaOH 在10 ℃下浸泡16 h，清水漂洗，利用0.05 mol/L HCl 在室溫下浸泡2 h 后，用蒸餾水漂洗至中性。經(jīng)過酸堿處理的魚皮利用80 ℃熱水浸提1 h 后，迅速冷卻至室溫，通過離心(15 000 ×g，25 ℃，20 min)分離獲得上清液，調(diào)制成蛋白濃度為2%的明膠蛋白溶液。將4 ℃下解凍的魚糜在冰浴條件下攪拌30 min，利用高剪切分散乳化機(jī)(16 000 r/min)均質(zhì)90 s，調(diào)制成蛋白濃度為2%的魚糜蛋白溶液。將明膠蛋白溶液和魚糜蛋白溶液按照1∶1 混合均勻后，調(diào)pH 至8.0，添加蛋白質(zhì)量20%的甘油制備成膜液。為了研究交聯(lián)劑對(duì)復(fù)合膜性質(zhì)的影響，膜液中分別添加了蛋白質(zhì)量0.025% ～0.2%的戊二醛或0.5% ～2.5%的TGase，然后利用攪拌脫泡機(jī)進(jìn)行脫泡。將脫泡后的成膜液(4 g)倒在5 cm× 5 cm 的有機(jī)硅樹脂框內(nèi)，先在溫度25 ℃下干燥15 h，接著在45 ℃下干燥1 h，最后冷卻至室溫進(jìn)行揭膜。將獲得的蛋白膜放在25 ℃，相對(duì)濕度50%的恒溫恒濕箱中平衡24 h 后，作為以下實(shí)驗(yàn)的測(cè)試樣品。

1.3.2 機(jī)械性能的測(cè)定

蛋白膜的機(jī)械性能按照參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 顏色和透明度值的測(cè)定

蛋白膜的顏色利用WSC-S 測(cè)色色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定。膜的顏色參數(shù)為L(zhǎng)*(黑－白)，a*(綠－紅)，b*(藍(lán)－ 黃)，其中白板的參數(shù)為L(zhǎng)*=91.86，a*= －0.88，b*=1.42。透明度值按照參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 蛋白溶解率和固形物溶解率的測(cè)定

將蛋白膜放在含有0.1% 疊氮鈉水溶液中，在30 ℃下保溫24 h 后，未溶解的蛋白膜利用105 ℃常壓干燥測(cè)定其重量，溶解在水中的蛋白根據(jù)Lowry法［12］進(jìn)行測(cè)定。蛋白膜在水中的蛋白溶解率為溶解的蛋白質(zhì)量占膜中總蛋白質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)，固形物溶解率為溶解的蛋白膜質(zhì)量占蛋白膜總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

1.3.5 交聯(lián)度的測(cè)定

蛋白膜用液氮研磨成粉末，在硅膠中干燥一周以上，其交聯(lián)度利用蛋白膜粉末根據(jù)Bubnis 等［13］的方法添加TNBS 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后利用乙醚萃取去除未反應(yīng)的TNBS 和TNP-α-氨基酸，并利用沸水浴去除殘留的乙醚后，在346 nm 下測(cè)定吸光度值。未添加交聯(lián)劑的蛋白膜的有效賴氨酸含量為100，交聯(lián)度計(jì)算:

式中，Ac和An分別為添加交聯(lián)劑和未添加交聯(lián)劑的樣品的吸光度值。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)

蛋白膜利用2%SDS、8 mol/L 尿素、2%β-巰基乙醇、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)蛋白變性劑進(jìn)行溶解后，溶解的蛋白利用8%的分離膠在8 mA 電流下進(jìn)行電泳，然后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液染色，最后用脫色液(V甲醇∶V乙酸∶V水=30∶10∶60)脫色到背景完全透明為止。

1.3.7 傅立葉變換紅外光譜( FTIR)

蛋白膜的FTIR 參照Tang 等［14］的方法進(jìn)行分析。將干燥的蛋白膜粉末與KBr 按1∶100 質(zhì)量比混合，研磨均勻后壓成薄片，利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行紅外表征，掃描波長(zhǎng)范圍為4 000 ～400 cm－1。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc，Chicogo，IL，USA)分析，用ANOVA 進(jìn)行方差分析，顯著性檢驗(yàn)方法為鄧肯多重檢驗(yàn)，檢測(cè)限為0.05［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械性能

表1 顯示了添加戊二醛、TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜機(jī)械性能的影響。

表1 添加戊二醛/TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜抗拉伸強(qiáng)度(TS)和斷裂延伸率(EAB)的影響Table 1 Effect of glutaraldehyde/TGase content on tensile strength(TS)and elongation at break(EAB)of surimi-gelatin composite films

從表1 可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)戊二醛添加量達(dá)到蛋白質(zhì)量0.1%時(shí)，魚糜-明膠復(fù)合膜的抗拉伸強(qiáng)度(TS)沒有發(fā)生顯著的變化(P＞0.05)，但進(jìn)一步提高戊二醛的添加量膜的TS 卻出現(xiàn)明顯的下降。利用TGase 對(duì)蛋白膜進(jìn)行性質(zhì)改良時(shí)，發(fā)現(xiàn)膜的TS 隨著TGase 的添加逐漸上升。當(dāng)TGase 添加量達(dá)到蛋白質(zhì)量的2.5%時(shí)，膜的TS 達(dá)到對(duì)照組的1.4 倍。結(jié)果表明TGase 更適合于改良魚糜-明膠復(fù)合膜的機(jī)械強(qiáng)度。這與報(bào)道的戊二醛與蛋白之間發(fā)生過度交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致蛋白膜的強(qiáng)度下降［8］，而TGase 與蛋白之間主要是通過酶促反應(yīng)形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)蛋白膜的強(qiáng)度［5，10，16］的結(jié)果類似。另一方面，添加一定量的戊二醛或者TGase，膜的EAB 都可以得到提高。通常，EAB 和TS 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［5］，但在本研究中沒有發(fā)生類似的傾向，這可能是由于戊二醛、TGase 的添加導(dǎo)致膜中蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，結(jié)果使膜的韌性、延展性都得到增強(qiáng)［17］。

2.2 顏色和透明度值

色澤是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo)，而膜的顏色與光的吸收、透過、反射等相關(guān)，通過測(cè)定膜的顏色可以反映出成膜過程中可能存在的反應(yīng)，復(fù)合膜顏色的測(cè)定結(jié)果如表2 所示。伴隨著戊二醛添加量的增加，膜的L*值、a*值略微下降，而b*值卻出現(xiàn)了明顯的上升(P＜0.05)。另一方面，添加TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜的L*值、a*值沒有顯著的影響，但b*值卻出現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)(P＜0.05)。戊二醛容易與蛋白中賴氨酸的氨基發(fā)生反應(yīng)生成席夫堿［18］，導(dǎo)致膜的顏色發(fā)黃，而TGase 只是促進(jìn)蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成ε-(γ-谷氨?；?-賴氨酸的異肽鍵［16］，不會(huì)對(duì)膜的顏色產(chǎn)生影響，因此添加戊二醛比添加TGase 更容易導(dǎo)致魚糜-明膠復(fù)合膜色澤變黃(表2)。

另一方面，由表2 還可以獲知，添加戊二醛對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜的透明度值沒有顯著影響(P＞0.05)，但TGase 的添加卻導(dǎo)致膜的透明度值下降。在本文中透明度值越高表示蛋白膜越不透明，因此在魚糜-明膠復(fù)合膜中添加TGase 會(huì)使膜變得更透明。這可能是TGase 促進(jìn)魚糜、明膠之間發(fā)生分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)形成致密均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，減少光的散射作用，導(dǎo)致膜的透光率增加［19］。

表2 添加戊二醛/TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜顏色和透明度值的影響Table 2 Effect of glutaraldehyde/TGase content on color and transparency value of surimi-gelatin composite films

2.3 溶解性

耐水性能是可食膜應(yīng)用于包裝食品時(shí)的重要特性，固形物溶解率可以作為蛋白膜的耐水性能指標(biāo)［20］。膜的固形物溶解率(FS)和蛋白溶解率(PS)的測(cè)定結(jié)果如表3 所示。

由表3 可以看出，魚糜-明膠復(fù)合膜的FS 為71.80%，說明魚糜和明膠混合制備的蛋白膜其耐水性能較差。不管是添加戊二醛還是添加TGase，伴隨著交聯(lián)劑的添加，膜的FS、PS 都出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。然而，表3 的結(jié)果表明戊二醛對(duì)于提高蛋白膜的耐水性能明顯優(yōu)于TGase。與本文結(jié)果類似，添加戊二醛可以使棉籽蛋白膜的溶解性降低65%以上［4］，但添加TGase 只能使大豆分離蛋白膜的 FS 下降21.6%［5］，這可能是戊二醛分子量小，容易與蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的緣故［18，21］。

2.4 交聯(lián)度

為了明確戊二醛、TGase 的添加對(duì)蛋白交聯(lián)的影響，利用TNBS 的方法進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，不管是戊二醛還是TGase 改良的蛋白膜，蛋白交聯(lián)度隨著交聯(lián)劑的添加都呈逐漸上升的趨勢(shì)，但添加效果明顯不同。添加蛋白質(zhì)量0.2%的戊二醛時(shí)蛋白交聯(lián)度就達(dá)到21%，而TGase 添加量增加到蛋白質(zhì)量的2.0%時(shí)其蛋白交聯(lián)度也只有17%左右，表明了戊二醛比TGase 更容易促進(jìn)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致戊二醛添加的魚糜-明膠復(fù)合膜的耐水性能明顯優(yōu)越(表3)。

表3 添加戊二醛/TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜的固形物溶解率(FS)和蛋白溶解率(PS)的影響Table 3 Effect of glutaraldehyde/TGase content on film solubility(FS)and protein solubility(PS)of surimi-gelatin composite films

圖1 添加戊二醛/TGase 對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜中蛋白交聯(lián)度的影響Fig.1 Effect of glutaraldehyde/TGase content on crosslinking degree of surimi-gelatin composite films

2.5 SDS-PAGE

SDS-PAGE 分析結(jié)果表明，魚糜-明膠復(fù)合膜中的主要蛋白成分為肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動(dòng)蛋白(Actin)、β 肽鏈和α 肽鏈(圖2)。伴隨著戊二醛的添加，MHC、β 肽鏈的條帶濃度減少，同時(shí)濃縮膠頂部的高分子組分(HMWF)的條帶濃度逐漸增加，其他蛋白條帶沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，表明戊二醛的添加主要促進(jìn)魚糜蛋白中的MHC、明膠蛋白β 肽鏈之間發(fā)生交聯(lián)形成HMWF。據(jù)報(bào)道，MHC 和明膠蛋白在TGase 的作用下也會(huì)發(fā)生類似的交聯(lián)反應(yīng)［10，22］。然而，在本研究中TGase 誘導(dǎo)產(chǎn)生的HMWF 含量明顯低于戊二醛，進(jìn)一步驗(yàn)證了戊二醛更容易促進(jìn)魚糜-明膠復(fù)合膜中蛋白交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。

圖2 魚糜-明膠復(fù)合膜的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of surimi-gelatin composite films

2.6 FTIR

為進(jìn)一步了解戊二醛、TGase 的添加對(duì)魚糜-明膠膜中蛋白之間相互作用的影響，利用FTIR 進(jìn)行了分析(圖3)。伴隨著蛋白膜中戊二醛含量的增加，代表NH 和OH 伸縮振動(dòng)的酰胺A 先向高波數(shù)方向移動(dòng)，當(dāng)戊二醛與蛋白的比例超過0.05%時(shí)，該特征峰開始向低波數(shù)移動(dòng)。而隨著TGase 含量的增加，酰胺A 逐漸向高波數(shù)方向移動(dòng)，當(dāng)含量增加至蛋白質(zhì)量的2.5%時(shí)，與對(duì)照組相比移動(dòng)了48.4 cm－1。據(jù)報(bào)道，蛋白膜的酰胺A 特征吸收峰向高波數(shù)方向移動(dòng)表示膜中的氫鍵作用相對(duì)減弱［23］。因此，圖3 的結(jié)果表明了少量的戊二醛可以使膜中蛋白分子間/分子內(nèi)的氫鍵作用相對(duì)減弱，但過量的戊二醛可能在促進(jìn)蛋白交聯(lián)的同時(shí)也破壞了蛋白的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致親水性自由基增多［24］，氫鍵作用相對(duì)增強(qiáng)(圖3)。從圖3 還可以看出，戊二醛的添加使酰胺Ⅰ(C = O 伸縮振動(dòng))、酰胺Ⅱ(NH 變形振動(dòng)或CN 伸縮振動(dòng))向高波數(shù)方向發(fā)生輕微移動(dòng)，而TGase 對(duì)這2 個(gè)特征吸收峰沒有產(chǎn)生明顯的影響，表明戊二醛的添加使膜中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［25］，而且戊二醛還可能與蛋白中的氨基發(fā)生交聯(lián)形成新的C－N 鍵。

3 結(jié)論

戊二醛和TGase 的添加對(duì)魚糜-明膠復(fù)合膜性能的影響效果明顯不同。戊二醛的添加不能提高膜的機(jī)械強(qiáng)度，也不會(huì)改變膜的透明性，但可以大幅度增加膜的耐水性能，使膜的顏色變黃。然而，添加TGase 不僅可以改良膜的機(jī)械性能、耐水性能和透明性，而且不會(huì)影響膜的色澤。根據(jù)SDS-PAGE 和FTIR 的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)戊二醛和TGase 都可以使成膜的蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)形成高分子聚合物，但戊二醛還可能使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白成膜性能下降。因此，本研究的結(jié)果表明TGase 更適合用于改良魚糜-明膠復(fù)合膜的理化性能。

圖3 添加戊二醛/TGase 的魚糜-明膠復(fù)合膜的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of surimi-gelatin composite films

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