氧化型／還原型小分子對蛋白質(zhì)錯誤折疊的影響

夏慧蕓，嚴(yán)向陽，王渭娜，宋莉芳

（1交通鋪面材料教育部工程研究中心，長安大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安710061；2陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安710062）

蛋白質(zhì)錯誤折疊和構(gòu)象改變相關(guān)疾病已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注，例如阿爾茨海默、帕金森綜合征、二型糖尿病等［1－8］，此類疾病都有著共同的特征：即在正常生理條件下，蛋白質(zhì)或多肽二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲和α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟摩抡郫B結(jié)構(gòu)，自組裝成直徑大約5～10nm、長度處于亞微米級或微米級、無支鏈纖維狀沉積物，統(tǒng)稱為“淀粉樣沉積”（Amyloid deposit）［9－12］．目前，淀粉樣纖維形成的機(jī)制尚不清楚，然而大量研究表明，這一過程與自由基的產(chǎn)生有密切聯(lián)系．自由基可以促進(jìn)淀粉樣沉積的聚集和纖維形成，同時在纖維形成的過程中也伴隨有自由基產(chǎn)生，淀粉樣沉積主要通過自由基發(fā)揮其強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用［13－17］．只要選用適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┎粌H可以抑制淀粉樣纖維形成，而且還可以對抗淀粉樣沉積的毒性作用，最終達(dá)到干預(yù)治療的目的［18］．

多酚類天然抗氧化產(chǎn)物化合物具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的作用．雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其能有效抑制淀粉樣纖維的生成和細(xì)胞毒性，但是作用機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系仍不清楚，這種抑制作用的強(qiáng)弱表面上與抗氧化能力強(qiáng)弱有關(guān)，事實上與氧化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)．本工作以體外小分子多酚化合物與淀粉樣沉積相互作用的研究為模型，采用結(jié)構(gòu)最簡單的對苯二酚、對苯二醌作為還原型、氧化型多酚類物質(zhì)的代表，從抑制纖維生長和逆轉(zhuǎn)成熟纖維結(jié)構(gòu)入手，借助多種表征方法，探討氧化型／還原型的酚／醌類物質(zhì)對抑制和逆轉(zhuǎn)作用的關(guān)系，為多酚類化合物治療淀粉樣纖維相關(guān)疾病的藥物篩選和設(shè)計有價值的實驗依據(jù)．

1 實驗

1．1 主要試劑與儀器

卵清溶菌酶購自Amersco公司；巰基硫黃素T（Th－t）購自Sigma公司；對苯二酚、對苯二醌等其他試劑均為分析純；實驗所用水為去離子二次蒸餾水，恒溫水浴箱（江蘇國華）；透射電子顯微鏡（JEM—2100，日本電子）；熒光分光光度計（LS—55，PE公司）．

1．2 對苯二酚和對苯二醌濃度的影響

纖維的制備參考文獻(xiàn)［19，20］：稱取10mg溶菌酶蛋白置于1．5mL Eppendorf管中，加入1mL HCl（10mmol／L，pH＝2．0），配制10mg／mL溶菌酶蛋白溶液，加入20μL 50mmol／L NaN3抑制菌類生長，密封，57℃孵育10d．

取20個1．5mL的Eppendorf管，2個試驗組，每組10個，各含有1mL 10mg／mL溶菌酶蛋白，第一個試驗組中依次分別加入終濃度為0、0．02、0．05、0．08、0．1、0．4、0．8、1．0、1．5、2mmol／L的對苯二酚；第二個試驗組中依次分別加入終濃度為0、0．02、0．05、0．08、0．1、0．4、0．8、1．0、1．5、2mmol／L的對苯二醌．搖勻，密封，570C恒溫孵育10d．用Th－t熒光探針檢測各濃度對淀粉樣纖維最終的生長抑制程度，最終的形貌通過透射電子顯微鏡來表征．

1．3 對苯二酚及對苯二醌的影響

用HCl（10mmol／L，pH＝2．0），將對苯二酚﹑苯二醌分別配置成10mmol／L（終濃度0．5mmol／L）的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用．

取2個5mL Eppendorf管，各加入400μL（10 mg／mL）成熟纖維，分別加入50μL 10mmol／L對苯二酚和對苯二醌（終濃度為0．5mmol／L），各加入50mmol／L pH＝7．4的磷酸鹽緩沖液至2mL，搖勻，密封，置于37℃恒溫孵育6d，第2天和第6天各取樣50μL用于表征．

1．4 孵育時間以及pH值的影響

取2個5mL Eppendorf管，各加入400μL（10mg／mL）成熟纖維，分別加入50μL終濃度為0．5mmol／L對苯二酚和對苯二醌，各加入50 mmol／L pH＝7．4的磷酸鹽緩沖液至2mL，搖勻，置于37℃恒溫孵育10d，每兩天取樣50μL進(jìn)行檢測．

1．5 Th－t熒光檢測

不同濃度的對苯二酚和對苯二醌對溶菌酶淀粉樣纖維形成的結(jié)果檢測：取50μL樣品，加入3mL 50mmol／L pH＝8．0Tris－HCl，加入20μLTh－t（終濃度20μmol／L），440nm激發(fā)，狹縫寬度10nm，檢測482nm處熒光強(qiáng)度［21－22］．

對苯二酚、對苯二醌對成熟纖維逆轉(zhuǎn)的結(jié)果檢測：取50μL樣品，加入3mL 50mmol／L pH＝8．0 Tris－HCl，加入20μL Th－t，440nm激發(fā)，狹縫寬度10nm，掃譜．

1．6 TEM表征

樣品稀釋至1mg／mL，取10μL滴于銅網(wǎng)上，用2%的磷鎢酸負(fù)染5min，在空氣中自然晾干，然后觀察．

1．7 對苯二酚對苯二醌量化計算

工作采用Gaussian03程序，用B3LYP方法在6－311＋＋g的水平上，對對苯二醌和對苯二酚化合物進(jìn)行計算，得到分子的電荷、分子軌道、偶極矩等信息．

2 結(jié)果與討論

2．1 不同濃度對苯二酚和對苯二醌對溶菌酶淀粉樣纖維形成的影響

圖1為溶菌酶淀粉樣溶液中加入不同濃度對苯二酚和對苯二醌時檢測的Th－t熒光強(qiáng)度的變化．從圖中可看出，當(dāng)對苯二酚和對苯二醌最終濃度為從0變化到1．0mmol／L時，Th－t熒光強(qiáng)度都隨濃度逐漸增大而降低，但降低幅度不同．這表明對苯二酚和對苯二醌對溶菌酶淀粉樣纖維生長都具有一定的抑制作用，但抑制程度（效率）不同，主要表現(xiàn)為最小有效抑制濃度不同：即對苯二酚為1．0mmol／L；對苯二醌為0．4mmol／L，這一結(jié)果說明對苯二醌對溶菌酶淀粉樣纖維的抑制作用強(qiáng)于對苯二酚．

圖1 不同濃度對苯二酚和對苯二醌對溶菌酶纖維生長抑制作用Fig．1 Inhibition of p－h(huán)ydroquinone and p－benzoquinone with different concentrations to the formation of lysozyme amyloid fibril

通過透射電子顯微鏡也觀察到對苯二酚和對苯二醌對溶菌酶淀粉樣纖維不同的抑制作用，如圖2所示．A圖是典型的淀粉樣纖維形貌，當(dāng)加入1．0 mmol／L對苯二酚和0．4mmol／L對苯二醌時，溶菌酶淀粉樣纖維的生長已經(jīng)完全抑制，無明顯的纖維形狀，變成無規(guī)聚集體（圖C，D）．當(dāng)對苯二酚濃度為0．4mmol／L時（B），沒有完全抑制淀粉樣纖維的生長，仍然能夠看到纖維狀物質(zhì)，只是密度變得沒有空白對照密集，結(jié)果與熒光檢測相同，對苯二醌抑制作用強(qiáng)于對苯二酚．

圖2 不同濃度對苯二酚及對苯二醌對溶菌酶纖維化作用的TEM照片F(xiàn)ig．2 TEM images of hydroquinone lysozyme amlyoid fibril in presence of p－h(huán)ydroquinone and p－benzoquinone with different concentration

2．2 對苯二酚、對苯二醌對成熟纖維的影響

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種成熟淀粉樣纖維對機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此我們探討了對苯二酚﹑對苯二醌對成熟纖維結(jié)構(gòu)的影響．成熟纖維在pH＝7．4的磷酸鹽緩沖液中，分別與0．5mmol／L對苯二酚﹑對苯二醌37℃孵育10d的條件下，通過Th－t熒光檢測對成熟纖維結(jié)構(gòu)影響，結(jié)果如圖3和圖4．Th－t熒光檢測在482nm處熒強(qiáng)度隨著孵育時間的延長逐漸減弱，說明淀粉樣纖維的結(jié)構(gòu)由規(guī)則的β－sheet轉(zhuǎn)變?yōu)棣粒環(huán)elix，兩者都可以對成熟纖維結(jié)構(gòu)起到逆轉(zhuǎn)作用．但是對苯二醌的熒光強(qiáng)度下降趨勢要明顯快于對苯二酚，對苯二酚熒光強(qiáng)度下降趨勢比較緩和，表明在pH＝7．4的磷酸鹽緩沖液中，對苯二醌的逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)于對苯二酚．

圖3 對苯二酚存在時隨孵育時間變化的疏基硫黃素T熒光光譜Fig．3 Fluorescence spectra of Th－t with time for the system of lysozyme amlyoid fibril in presence of p－h(huán)ydroquinone

圖4 對苯二醌存在時隨孵育時間變化的巰基硫黃素T熒光光譜Fig．4 Fluorescence spectra of Th－t with time for the system of lysozyme amlyoid fibril in presence of p－benzoquinone

通過透射電子顯微鏡也可以看到對苯二酚和對苯二醌對成熟纖維的逆轉(zhuǎn)作用，結(jié)果如圖5．通過6 d的孵育，都已經(jīng)沒有纖維狀形貌（圖5A，B），變成無規(guī)聚集體，這種結(jié)構(gòu)的變化可以有效地降低成熟纖維對機(jī)體細(xì)胞的毒性［23］．

圖5 對苯二酚（A）和對苯二醌（B）逆轉(zhuǎn)成熟纖維的TEM照片F(xiàn)ig．5 TEM images of mature fiber reversed in presence of p－h(huán)ydroquinone（A）and p－benzoquinone（B）

為了考察pH值對成熟纖維逆轉(zhuǎn)的影響，進(jìn)一步將磷酸鹽緩沖液介質(zhì)pH控制為6．5，對苯二酚和對苯二醌最終濃度仍然保持為0．5mmol／L時，考察其對成熟纖維的影響，結(jié)果見圖6．從圖可看出，在偏酸性環(huán)境中，對苯二醌對成熟纖維基本無作用，對苯二酚卻有明顯的逆轉(zhuǎn)效果．這一結(jié)果表明，在偏酸性條件下對苯二酚的逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)于對苯二醌，與上述討論結(jié)果恰恰相反．

圖6 對苯二酚、對苯二醌存在時孵育時間變化的巰基硫黃素T熒光光譜Fig．6 Fluorescence spectra of Th－t for the system of lysozeme amlyoid fibril in presence of p－h(huán)ydroquinone or p－benzoquinone

2．3 量化計算結(jié)果

通過Gaussian 03軟件對對苯二酚和對苯二醌的有效電荷、HOMO、LOMO進(jìn)行計算（6－311＋＋g水平優(yōu)化），結(jié)果如表1．分子的凈電荷反映了分子間靜電吸引的能力，最低空軌道能量越低，越容易接受電子，最高占有軌道能量越高越容易提供電子，故分子的前線軌道反映了形成分子間氫鍵的能力．由此看來，與對苯二酚相比，對苯二醌具有較大的靜電吸引的能力和成分子間氫鍵的能力，在高溫（56℃）孵育條件下，介質(zhì)的質(zhì)子化作用相對比較弱，因此即使在pH＝2的生長環(huán)境中，對苯二醌的抑制能力仍然強(qiáng)于對苯二酚，也就是說對苯二醌結(jié)合蛋白的能力強(qiáng)于對苯二酚，在弱堿性環(huán)境中的逆轉(zhuǎn)，溶劑質(zhì)子化可以忽略，同樣對苯二醌強(qiáng)于對苯二酚，但是在溫度較為溫和的弱酸性環(huán)境中（37℃），出現(xiàn)相反結(jié)果的原因就是對苯二醌自身對溶劑質(zhì)子化作用占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致對苯二醌本身量化參數(shù)的改變，自身的質(zhì)子化降低了與蛋白質(zhì)的進(jìn)一步相互作用，從而逆轉(zhuǎn)效果不如對苯二酚．

3 結(jié)論

對苯二酚﹑對苯二醌小分子化合物對溶菌酶淀粉樣纖維的形成有抑制作用，在弱堿性環(huán)境中對成熟纖維有結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)的作用，而且還原型對苯二醌作用強(qiáng)于氧化型對苯二酚，但是在弱酸性環(huán)境中，由于溶劑質(zhì)子化作用，對苯二醌的逆轉(zhuǎn)效率低于對苯二酚．對苯二酚可以很容易轉(zhuǎn)化成對苯二醌，醌式結(jié)構(gòu)強(qiáng)于酚式結(jié)構(gòu)，這對設(shè)計藥物有很大的指導(dǎo)意義；同時引入量化計算，結(jié)合這對氧化還原型小分子，對復(fù)雜天然產(chǎn)物抑制淀粉樣纖維疾病的差異在一定程度上可給予解釋．

［1］Obici L，Perfetti V，Palladini G，et al．Clinical aspects of systemic amyloid diseases［J］．Biochimica et Biophysica Acta，2005，1753（1）：11－22．

［2］Koo E H，Lansbury P T J，Kelly J W．Amyloid diseases：abnormal protein aggregation in neurodegeneration［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences，1999，96（18）：9989－9990．

［3］Makin O S，Serpell L C．Structures for amyloid fibrils［J］．FEBS Journal，2005，272（23）：5950－5961．

［4］Clark K，Nilsson M R．Islet amyloid：a complication of islet dysfunction or an aetiological factor in type 2diabetes［J］．Diabetologia，2004，47（2）：157－169．

［5］曹傲能，汪蔚學(xué)，宇文泰然，等．小熱休克蛋白MjHSP16．5對多肽纖維生長的抑制及對成熟纖維的解聚作用［J］．物理化學(xué)學(xué)報，2010，26（7）：2015－2020．

［6］Armen R S，Daggett V．Characterization of two distinct β2－microglobulin unfolding intermediates that may lead to amyloid fibrils of different morphology［J］．Biochemistry，2005，44（49）：16098－16107．

［7］Hong D P，F(xiàn)ink A L．Independent heterologous fibrillation of insulin and its B－chain peptide［J］．Biochemistry，2005，44（50）：16701－16709．

［8］Poirier M A，Li H，Macosko J，et al．Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization［J］．Journal of Biological Chemistry，2002，277（43）：41032－41037．

［9］Kakuyama H，S derberg L，Horigome K，et al．CLAC binds to aggregated abeta and abeta fragments，and attenuates fibril elongation［J］．Biochemistry，2005，44（47）：15602－15609．

［10］Dobson C M．The structural basis of protein folding and its links with human disease［J］．Philosophical Transactions of the Royal Society B：Biological sciences，2001，356（1406）：133－145．

［11］Sato T，Kienlen－Campard P，Ahmed M，et al．Inhibitors of amyloid toxicity based on beta－sheet packing of A beta 40and A beta 42［J］．Biochemistry，2006，45（17）：5503－5516．

［12］Cohen T，F(xiàn)rydman－Marom A，Rechter M，et al．Inhibition of amyloid fibril formation and cytotoxicity byhydroxyindole derivatives［J］．Biochemistry，2006，45（15）：4727－4735．

［13］Karsai A，Nagy A，Kengyel A，et al．Effect of lysine－28side－chain acetylation on the nanomechanical behavior of alzheimer amyloid beta25－35fibrils［J］．Journal of Chemical Information and Modeling，2005，45（6）：1641－1646．

［14］Dyrks T E，Dyrks T，Hartmann C，et al．Amyloidogenicity of beta A4and beta A4－bearing amyloid protein precursor fragment s by met a－l catalyzed oxidation［J］．Journal of Biological Chemistry，1992，267（25）：18210－18217．

［15］Butterfield D A，Hensley K，Harris M，et al．B－amyloid peptide free radical fragmnts initiate snaptosomal lipoperoxidat ion in a sequence－specific fashion：implicat ions to Alzheimer disease［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，1994，200（2）：710－715．

［16］Hensley K，Carney J M，Mattson M P，et al．A model for B－amyloid aggregate ion and neurotoxicity based on free radical generation by the peptide：relevance to Alzheimer disease［J］．Proceedings of the National A－cademy of Sciences，1994，91（8）：3270－3274．

［17］庾照學(xué)，汪華僑，袁群芳，等．抗氧化劑TA9901抑制加速老化鼠腦淀粉樣顆粒的沉積［J］．解剖學(xué)報，2002，30（1）：28－32．

［18］姚志彬．以Aβ為靶的老年性癡呆的治療策略［M］∥陳可冀．老年性癡呆發(fā)病機(jī)理與診治．北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：227－228．

［19］He Jing，Xing Yanfei，Huang Bo，et al．Tea catechins induced the conversion of preformed lysozyme amyloid fibrils to amorphous aggregates［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（23）：11391－11396．

［20］Arnaudov L N，De V R．Thermally induced fibrillar aggregation of hen egg white lysozyme［J］．Biophysical Journal，2005，88（1）：515－526．

［21］Frare E，Polverino D L P，Zurdo J，et al．A highly amyloidogenic region of hen lysozyme［J］．Journal of Molecular Biology，2004，340（5）：1153－1165．

［22］Levine H．Thioflavine T interaction with synthetic alzheimer′s disease detection of amyloid aggregation in solution［J］．Protein Science，1993，2（3）：404－410．

［23］Nilsson M R．Techniques to study amyloid fibril formation in vitro［J］．Methods，2004，340（1）：151－160．