MTT法評(píng)價(jià)3種雞腿菇多糖的體外抗腫瘤活性

李佳媚，劉娜女，孫潤(rùn)廣

（陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，陜西 西安710062）

多糖在生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著非常重要的作用，由于多糖具有獨(dú)特的生物、化學(xué)和物理特性，近年來對(duì)多糖的研究非常廣泛，已有研究表明大部分中草藥多糖都具有特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)且相對(duì)毒性較低的特點(diǎn)［1］．目前對(duì)菌類多糖的研究也較多，許多專家學(xué)者的研究表明香菇多糖能顯著的抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［2－3］，除了香菇多糖外，許多真菌多糖都具有很好的生物活性．雞腿菇作為一種藥食兼用的真菌具有豐富的藥用保健活性，已經(jīng)有的研究表明：雞腿菇中含有豐富的生物活性成分，如糖類和蛋白質(zhì)等，雞腿菇多糖具有抗氧化、降血壓、防止肝硬化、提高免疫力、抗菌、抗腫瘤等功效［4－5］．

目前對(duì)植物多糖的研究非常廣泛，有學(xué)者的研究表明超聲提取的龍眼多糖的理化性質(zhì)發(fā)生了改變，并且超聲處理可引起多糖微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［6］，超聲處理高直鏈玉米淀粉后多糖的分子量發(fā)生降解，黏性下降，水溶性升高［7］；許多學(xué)者的研究表明硫酸化修飾后的多糖的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)［8－9］，文獻(xiàn)［10］報(bào)道等對(duì)平菇多糖進(jìn)行硫酸化修飾后多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用顯著且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)．文獻(xiàn)［11］研究發(fā)現(xiàn)硫酸酯化修飾的多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的入侵與遷移有抑制作用并且具有劑量依賴效應(yīng)；對(duì)多糖進(jìn)行羧甲基化修飾也會(huì)使多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等發(fā)生改變［12］．因此對(duì)多糖進(jìn)行不同的化學(xué)方法處理會(huì)影響多糖的理化性質(zhì)及生物活性．本實(shí)驗(yàn)采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法［13－14］評(píng)價(jià)超聲輔助提取雞腿菇多糖經(jīng)季銨鹽沉淀分級(jí)得到的堿性組分（UCP－3）、經(jīng)過硫酸酯化修飾的雞腿菇多糖（SWCP）和經(jīng)過羧甲基化修飾的雞腿菇多糖（CWCP）對(duì)人白血病K562細(xì)胞的體外增殖的影響作用，并分析比較不同的提取方法和化學(xué)修飾對(duì)雞腿菇多糖體外抗腫瘤活性的影響．

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 材料 雞腿菇相關(guān)多糖WCP、UCP－3、SWCP、CWCP，由陜西師范大學(xué)生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程研究室制備；K562細(xì)胞來自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心．

1．1．2 試劑 主要試劑包括：無支原體新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI Medium 1640，美國(guó)Gibco公司；MTT，美國(guó)Amresco公司；DMSO；醫(yī)用酒精；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭粚?shí)驗(yàn)所用水均為三次蒸餾水．

1．2 儀器

Olympus TH4－200倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HH．CP－01W型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YP601N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL80－2B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DG5032型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；SZ－97自動(dòng)三重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；CF16RX高速離心機(jī)，日本日立公司．

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 雞腿菇相關(guān)多糖的制備方法 雞腿菇相關(guān)多糖的制備具體過程如下：

（1）雞腿菇多糖WCP制備：鮮雞腿菇烘干粉碎后稱重，加4倍體積80%乙醇脫脂（20min，3次），之后抽濾烘干并稱重，加10倍體積水沸水浴煮2．5 h，重復(fù)3次，室溫下4 000r／min離心10min，上清液經(jīng)真空濃縮后醇沉，沉淀透析3d，冷凍干燥后即得沸水浴法提取雞腿菇多糖WCP．

（2）超聲提取雞腿菇多糖UCP－3制備：參照文獻(xiàn)［15］的方法，鮮雞腿菇烘干粉碎后稱重，加4倍體積80%乙醇脫脂（20min，3次），之后抽濾烘干并稱重，加10倍體積水后超聲波提取15min（每次10s、90次、間隔15s，功率300W）重復(fù)提取3次后室溫下4 000r／min離心10min，上清液經(jīng)真空濃縮后醇沉，沉淀透析3d，冷凍干燥后即得超聲輔助法提取雞腿菇粗多糖UCP，經(jīng)季銨鹽沉淀后取堿性組分UCP－3備用．

（3）硫酸酯化雞腿菇多糖SWCP的制備：參照李國(guó)榮［16］等的方法．采用氯磺酸－吡啶法制備硫酸酯化雞腿菇多糖，在酯化試劑體積比為V（氯磺酸）∶V（吡啶）為1∶3，反應(yīng)溫度保持在90℃，反應(yīng)時(shí)間2h的條件下制備SWCP，保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）羧甲基化雞腿菇多糖CWCP的制備：參照周瑞［17］等的方法．將0．5g雞腿菇多糖溶解于38 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的NaOH溶液中，攪拌1h；然后加入溶有6g氯乙酸的異丙醇混合溶液50mL，保持55℃反應(yīng)5h；停止反應(yīng)冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值為中性，透析3d；冷凍干燥即得CWCP，保存?zhèn)溆茫?/p>

1．3．2 MTT法檢測(cè)不同雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制活性 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狀態(tài)良好的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL接種到96孔板中，每孔100μL細(xì)胞懸液，放入37℃，5%二氧化碳和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24h后，調(diào)零孔和對(duì)照組每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基溶液，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入100μL的WCP、UCP－3、SWCP和CWCP糖溶液（濃度分別為25、50、100、200和400μg／mL），每組做6個(gè)平行，繼續(xù)分別培養(yǎng)24，48和72h后，每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL放入孵箱培養(yǎng)4h，1 000r／min離心5min，棄去上清液，每孔加入200μL的DMSO，輕微振蕩15 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm下測(cè)光吸收值OD．按照如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2．1 雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

雞腿菇多糖WCP體外對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用觀察結(jié)果見表1和圖1．對(duì)不同濃度的雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞作用不同時(shí)間的MTT比色結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，表明各組間沒有顯著性差異，由結(jié)果可知，雞腿菇多糖WCP對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用．

表1 不同濃度WCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab．1 The MTT result of different concentration WCP at different time

圖1 不同濃度WCP作用K562細(xì)胞24h，48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig．1 Inhibition ratio of K562cells after treated with WCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．2 超聲提取雞腿菇多糖UCP－3對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

超聲提取得到的雞腿菇多糖UCP－3對(duì)K562細(xì)胞體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表2和圖2所示．從中可以發(fā)現(xiàn)超聲提取雞腿菇多糖UCP－3對(duì)K562細(xì)胞體外增殖具有抑制作用，在雞腿菇多糖UCP－3濃度為25～100μg／mL之間及作用時(shí)間為24h時(shí)抑制作用沒有顯著性差異，其余濃度點(diǎn)和時(shí)間點(diǎn)的抑制作用均顯著（P＜0．05或P＜0．01），隨著多糖濃度和時(shí)間的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)，當(dāng)超聲提取雞腿菇多糖UCP－3的濃度為400μg／mL和作用時(shí)間為72h時(shí)抑制效果最好，抑制率可達(dá)到27．90%（P＜0．01）．有學(xué)者研究表明超聲波會(huì)改變多糖的空間結(jié)構(gòu)［18－19］，超聲波對(duì)多糖進(jìn)行處理后會(huì)使多糖鏈中更多的官能團(tuán)暴露，從而促進(jìn)其生物活性的表達(dá)．劉娜女的研究表明UCP－3為分子量單一且不含糖醛酸、蛋白質(zhì)、多肽和核酸等雜質(zhì)的多糖，由此可說明超聲提取的雞腿菇多糖UCP－3是相對(duì)純的生物多糖，排除了雞腿菇中其他組分的干擾，具有抑制人白血病K562細(xì)胞體外增殖的活性．

表2 不同濃度UCP－3作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab．2 The MTT result of different concentration UCP－3at different time

圖2 不同濃度UCP－3作用K562細(xì)胞24h，48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig．2 Inhibition ratio of K562cells after treated with UCP－3in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．3 硫酸酯化雞腿菇多糖SWCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

硫酸酯化修飾的雞腿菇多糖SWCP對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表3和圖3所示．雞腿菇多糖經(jīng)過硫酸酯化修飾后對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并且隨著多糖濃度和時(shí)間的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有濃度效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)．單因素方差分析結(jié)果顯示硫酸酯化雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制除濃度為25μg／mL與作用時(shí)間24h時(shí)不具有顯著性差異外，其余作用點(diǎn)均表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0．05或P＜0．01），當(dāng)硫酸酯化雞腿菇多糖的濃度為400μg／mL和作用時(shí)間為72h時(shí)它對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制率最高可達(dá)到38．95%．多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)緊密相關(guān)，多糖硫酸酯化修飾后由于所帶硫酸基團(tuán)的空間位阻和靜電排斥效應(yīng)改變了多糖原來的空間結(jié)構(gòu)，增加了糖鏈的屈伸度，提高了水溶性，從而引起生物活性的改變［20］．硫酸酯化多糖處理癌細(xì)胞使細(xì)胞膜損壞或裂解成碎片，細(xì)胞漿濃縮和誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡［21］，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)．

表3 不同濃度SWCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab．3 The MTT result of different concentration SWCP at different time

圖3 不同濃度SWCP作用K562細(xì)胞24h，48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig．3 Inhibition ratio of K562cells after treated with SWCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

2．4 CWCP對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的作用

羧甲基化修飾的雞腿菇多糖CWCP對(duì)K562細(xì)胞的體外生長(zhǎng)影響結(jié)果如表4和圖4所示．羧甲基化雞腿菇多糖對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖抑制在每個(gè)作用點(diǎn)均具有顯著性（P＜0．01），雞腿菇多糖經(jīng)過羧甲基化修飾后對(duì)K562細(xì)胞的體外增殖表現(xiàn)出抑制作用，隨著多糖濃度的升高抑制作用逐漸增強(qiáng)，隨著作用時(shí)間的增加抑制作用逐漸減弱，魏文青等［22］的研究表明腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一個(gè)最佳的作用時(shí)間，在最佳作用時(shí)間之前隨著作用時(shí)間的增加其抑制作用增強(qiáng)，超過這個(gè)最佳作用時(shí)間后抑制作用隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而減弱．在羧甲基化雞腿菇多糖的濃度為400μg／mL和作用時(shí)間為24h是抑制率最高可達(dá)到31．17%．目前已經(jīng)有研究表明對(duì)多糖進(jìn)行化學(xué)修飾有助于提高其生物學(xué)活性，羧甲基化多糖能夠顯著提高多糖的電負(fù)性和水溶性，進(jìn)而增強(qiáng)多糖的生物活性［23］；此外化學(xué)基團(tuán)的引入也可能會(huì)增強(qiáng)多糖的活性，使多糖產(chǎn)生新的活性，具體還有待進(jìn)一步研究．

表4 不同濃度CWCP作用不同時(shí)間后MTT比色結(jié)果Tab．4 The MTT result of different concentration CWCP at different time

圖4 不同濃度CWCP作用K562細(xì)胞24h，48h和72h后細(xì)胞增殖抑制率Fig．4 Inhibition ratio of K562cells after treated with CWCP in different concentrations for 24h，48hand 72h

3 小結(jié)與討論

對(duì)3種不同的雞腿菇多糖的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明對(duì)多糖采用不同方法提取與化學(xué)修飾會(huì)影響多糖的體外抗腫瘤活性，并且影響效果不同，化學(xué)修飾后多糖的抗腫瘤活性有所提高，這與很多文獻(xiàn)報(bào)道一致．由此可見對(duì)雞腿菇多糖進(jìn)行不同的提取方法和修飾手段處理后其體外生物活性會(huì)發(fā)生變化．多糖作為一種有效的功能成分，副作用少，多種功效已經(jīng)被證明，本試驗(yàn)通過對(duì)雞腿菇多糖進(jìn)行不同的處理和結(jié)構(gòu)修飾后研究其體外抗腫瘤活性，為開發(fā)高效、低毒的多糖類抗腫瘤藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

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