RBPMS不同剪接體的真核表達和亞細胞定位

付潔 ，王瑜 ，程龍 ，徐小潔 ，張浩 ，宋海峰 ，葉棋濃

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.生物工程研究所；b.放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；北京 100850

RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）參與RNA前體的剪接、RNA的細胞定位、RNA的穩(wěn)定性等多種轉(zhuǎn)錄后過程。已知的含有RNA識別基序（RNA recognition motif，RRM）的RBP是一類含有一個或數(shù)個RRM結(jié)構(gòu)域及附屬結(jié)構(gòu)域的RBP。RRM也被稱為核糖核蛋白基序（ribonucleoprotein motif，RNP motif）或共有序列RNA結(jié)合域（consensus se?quence RNA-binding domain，CS-RBD）[1-2]，在哺乳動物組織細胞的生長和分化過程中扮演重要角色，但目前對這類蛋白功能的了解還處于初級階段。

含RRM的RBP在表達量變化或突變后將引起發(fā)育異常和疾病，如Elav類蛋白，其家族包括HuD、HuC、Hel-N1和HuR，該類蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中起重要作用，與癡呆癥、小腦退行性病變、腦干炎或脊髓炎等某些神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病有關(guān)。此外，RNA結(jié)合基序（RNA binding motif，RBM）的基因也是在Y染色體上克隆到的含有RRM結(jié)構(gòu)域的男性不育相關(guān)基因，同樣含有RRM結(jié)構(gòu)域的TLS（translocated in liposarcoma）基因與人黏液樣脂肪肉瘤的發(fā)生有關(guān)[3]。含RRM的RNA結(jié)合蛋白HuR可以與CAT1 mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合，減弱miR-122的活性[4]。此外，另一種進化上保守的RNA結(jié)合蛋白Dnd1（dead end 1）能抑制幾種miRNA與其靶標mRNA位點相互作用，阻礙miRNA的功能，且Dnd1的RRM結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒nd1發(fā)揮抑制miRNA的功能是必需的，揭示了這種在保護某些mRNA免受miRNA介導(dǎo)的抑制中的新作用，也揭示了miRNA調(diào)控中的一條新途徑[5-6]。SRSF1也是含多個RRM結(jié)構(gòu)域的RBP（也叫做SF2/ASF或ASF/SF2），研究表明，SRSF1在乳腺癌組織中高表達，可通過RRM結(jié)構(gòu)域促進BCL2L11和BIN1的剪切[7]，并可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的2種剪接體促轉(zhuǎn)移VEGF（165）a和抗轉(zhuǎn)移VEGF（165）b的相對變化水平，使得細胞侵襲性增加[8]。此外，SRSF1可參與cas?pase-9的選擇性剪接過程，及其在非小細胞肺癌中增強化療敏感性的作用[9]。綜上，目前報道的含RRM的RBP在調(diào)控機體功能方面的研究具有重要意義，且具有深入闡明其功能的必要性。

具有多種剪接形式的RNA結(jié)合蛋白（RBP with multiple splicing，RBPMS，又名 Hermes）基因是1996年在研究Werner綜合征時首次發(fā)現(xiàn)的。該基因位于人類染色體8p11-12上，染色體8p是Werner綜合征相關(guān)基因富集區(qū)[10]，且染色體8p的異?？梢詫?dǎo)致直腸癌、前列腺癌等多種疾病[11-12]。RBPMS含有RRM結(jié)構(gòu)域，主要有RBP1/4、RBP2和RBP3等3種剪接體，不同剪接體的N端高度同源，有RBM，該基序在脊椎動物和昆蟲中是保守的，C端富含α螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對于RNA識別的序列特異性具有重要作用，C端具有長度和氨基酸差異。目前對RBPMS的研究較少，已明確其在心臟分化過程中起重要作用，在分化的心肌中高表達，可以調(diào)節(jié)心肌分化所需要的成熟RNA。然而，如果RBPMS在發(fā)育的胚胎中過表達卻會抑制心臟的發(fā)育，導(dǎo)致一些編碼心肌分化標志物的成熟RNA缺失，全部的心肌形態(tài)學(xué)發(fā)育停止。此外，RBPMS在腎臟分化所需要的mRNA代謝過程中也起調(diào)節(jié)作用[13]。我們擬構(gòu)建RBPMS的3種剪接體形式，以及RRM結(jié)構(gòu)域缺失的表達載體，初步對其基因表達產(chǎn)物的亞細胞進行定位實驗，為深入了解該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細胞株由本實驗室保存（用含10%熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱）；大腸桿菌DH5α和綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C1由本實驗室保存；Lipo?fectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基購自Invit?rogen公司；小牛血清購自杭州四季青公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自Promega公司；DAPI染色液和顯色液均購自威格拉斯公司；預(yù)染蛋白marker購自Fermentas公司；抗綠色熒光蛋白αR-GFP抗體和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司；擴增基因片段的PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以卵巢cDNA文庫（Clontech公司產(chǎn)品）為模板，設(shè)計不同的引物擴增不同剪接體。RBP1/4、RBP2和RBP3基因的GenBank登錄號分別為NM_001008710、NM_001008711、NM_001008712[14]，3 種剪接體氨基酸序列比對結(jié)果見圖1。用上游引物RBP GFP Eco（5'CCGGAATTCTATGAACAACGGC GGCAAAGC3'）和下游引物RBPA GFP Bam（5'CGC GGATCCTCAGCAGAACTGACGGGA3'）擴增 RBP1/4剪接體；用上游引物RBP GFP Eco和下游引物RBPBGFPBam（5'CGCGGATCCTCAAACAGGAA ACCAGGCCA3'）擴增RBP2剪接體；用上游引物RBP GFP Eco和下游引物RBP GFP Bam（5'CGCG GATCCTCAACATGGGAGCTCCCT3'）擴 增 RBP3 剪接體。PCR體系按照Primestar體系說明書進行。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 7 min。用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物插入經(jīng)同樣雙酶切的pEGFP-C1載體，得到重組質(zhì)粒pEGFP-RBP1/4、pEGFP-RBP2、pEGFP-RBP3，將其分別與綠色熒光蛋白EGFP的C端融合表達，以觀察不同RBPMS剪接體蛋白在細胞中的定位。

此外，利用重組PCR技術(shù)將RBPMS剪接體的RRM缺失，以觀察RRM結(jié)構(gòu)域?qū)Χㄎ坏挠绊?。引物?RRM-primer1（同RBP GFP Eco）、RRM-prim?er4（同 RBP GFP Bam）、RRM-primer2（5'TGCCTTA GCCCGGACCTC3'）、RRM-primer3（5'GAGGTCCGG GCTAAGGCA-3'）。以 pEGFP-RBP3 為模板，用引物 RRM-primer1和 RRM-primer2擴增片段 1（72 bp）、RRM-primer3和RRM-primer4擴增片段2（376 bp），以片段1和2混合為模板，用引物RRM-primer1和RRM-primer4擴增獲得RRM結(jié)構(gòu)域的RBPMS。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min。最后獲得的PCR產(chǎn)物（448 bp）用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，插入經(jīng)同樣雙酶切的pEGFP-C1載體，得到重組質(zhì)粒pEGFP-C1-RBP/RRM-。

1.3 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染

用含10%新生牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，用不含雙抗、含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基將人胚腎細胞293T接種于12孔板中，接種量以轉(zhuǎn)染時細胞密度達到70%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉(zhuǎn)染。分別將 2.5 μg pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFP-C1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-、pEGFP-C1按照LipofectAMINE2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h后收獲細胞，用于Western印跡分析。

1.4 Western印跡

轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉稀釋的抗體αR-GFP，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 RBPMS蛋白的細胞內(nèi)定位檢測

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-分別轉(zhuǎn)染293T細胞。首先將293T細胞接種于盛有蓋玻片的24孔板中，轉(zhuǎn)染過程見前述，細胞密度不宜超過30%，同時轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1對照，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h后將細胞固定染核，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗細胞，用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，用PBS洗細胞3次，每次10 min，DAPI染色5 min，用PBS洗細胞2次，每次5 min，將蓋玻片封片固定到載玻片上，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1 不同剪接體重組質(zhì)粒的鑒定

首先從人卵巢cDNA文庫中PCR擴增RBPMS不同剪接體基因的完整編碼區(qū)，分別獲得長約591、615、660、438 bp的cDNA片段，對應(yīng)RBP1/4、RBP2、RBP3和RBP/RRM-（圖2），將各基因片段克隆到帶GFP標簽的經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切的真核表達載體pEGFP-C1上，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定（圖3）并測序，幾種RBPMS編碼區(qū)序列完全正確（數(shù)據(jù)略），證明克隆成功。

2.2 帶GFP標簽的RBPMS不同剪接體的表達

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-分別轉(zhuǎn)染293T細胞，同時轉(zhuǎn)空載體pEGFP-C1作為對照，收集細胞總蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE和Western印跡分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-、pEGFP-C1的真核細胞分別表達相對分子質(zhì)量約54×103、55×103、57×103、48×103和30×103的蛋白質(zhì)，與預(yù)期結(jié)果相同（圖4），證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒能介導(dǎo)RBPMS不同剪接體在真核細胞中表達。

圖1 用DNAMAN軟件比對RBP1/4、RBP2和RBP3的氨基酸序列

圖2 RBPMS基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖

圖3 RBPMS基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳圖

2.3 RBPMS不同剪接體形式蛋白在細胞內(nèi)的定位

將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-RBP1/4、pEGFPC1-RBP2、pEGFP-C1-RBP3、pEGFP-C1-RBP/RRM-和pEGFP-C1空載體轉(zhuǎn)染293T細胞，在激光共聚焦熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的細胞中的熒光分布于整個細胞，而轉(zhuǎn)染了不同RBPMS剪接體的重組質(zhì)粒的微觀分布模式各不相同。pEGFPC1-RBP1/4圍繞胞核在核膜的周圍呈聚集狀分布；pEGFP-C1-RBP2則在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，但會出現(xiàn)斑點狀聚集；pEGFP-C1-RBP3呈半月狀緊密分布在細胞核周圍；而RRM結(jié)構(gòu)域缺失后的pEGFP-C1-RBP/RRM-的上述現(xiàn)象消失，與空載體對照類似，在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布。

3 討論

圖4 帶EGFP標簽的RBPMS在293T細胞中的表達

mRNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在基因表達調(diào)控中具有重要作用，基因在核內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄后，新合成的pre-mRNA或核異質(zhì)RNA（hnRNA）通過加帽、剪接和加尾等一系列反應(yīng)成為成熟的mRNA，并被轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)內(nèi)mRNA的定位、翻譯和代謝等過程受到嚴格的調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控決定著基因表達的最終產(chǎn)物的種類和表達量[1]。目前已在動物、植物、真菌和細菌等不同物種中發(fā)現(xiàn)了約300個含RRM的RBP，該類蛋白參與RNA生物學(xué)活性調(diào)節(jié)的每一步驟，包括轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA的剪接、RNA加尾修飾、轉(zhuǎn)運、定位、翻譯和代謝，并貫穿和連接這一系列過程，在功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮其多樣性[15-17]。

作為含RRM的RBP之一，目前對RBPMS的報道較少,其生物學(xué)功能仍有待闡明。Northern雜交實驗表明RBPMS基因在人的心臟、前列腺、腸道和卵巢中有較強的探針雜交帶，在腦、骨骼肌、脾臟、胸腺和外周血淋巴細胞中表達較弱，提示RBPMS的表達受到組織特異性調(diào)節(jié)。事實上，RBPMS的C端的一些外顯子在不同的器官和細胞中表達是不盡相同的，但含有RBM的N端相對保守。比如，RT-PCR結(jié)果顯示，外顯子Ⅵ在HeLa細胞中表達，但在成纖維細胞中檢測不到。此外，RBPMS基因的啟動子區(qū)域含有許多轉(zhuǎn)錄因子，如AP2、NF1、Sp1和NF-E1等的結(jié)合位點，提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)節(jié)RBPMS基因的轉(zhuǎn)錄活性[9]。為了有效地與RNA結(jié)合，RBP通常需要組裝成多蛋白復(fù)合體，免疫沉淀實驗表明，細胞中RBPMS以多拷貝形式存在[12]，也提示RBPMS可能和RNA結(jié)合，干預(yù)RNA的轉(zhuǎn)運、定位和功能等。

在本研究中，我們構(gòu)建并表達了RBPMS不同剪接體及RRM結(jié)構(gòu)域缺失的真核表達載體，并且利用激光共聚焦顯微鏡初步觀察了RBPMS的微觀分布。對表達蛋白細胞內(nèi)定位的研究表明，不同形式的RBPMS蛋白的細胞微觀分布模式明顯不同，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的細胞中熒光信號彌散分布于整個細胞內(nèi)，主要定位在胞漿中；而RBP1/4、RBP3略同，呈聚集狀緊密圍繞細胞核分布；RBP2在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，但會出現(xiàn)斑點狀聚集；RRM結(jié)構(gòu)域缺失后，會改變RBPMS的分布模式。幾種不同形式的RBPMS的微觀定位，提示其調(diào)節(jié)翻譯過程和mRNA的穩(wěn)定性，且不同的剪接體發(fā)揮不同的功能。這為進一步了解RBPMS基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖5 激光共聚焦實驗顯示不同RBPMS的細胞微觀分布

RRM結(jié)構(gòu)域?qū)蛭⒂^分布模式有影響。冷泉港實驗室的Spector研究小組提出[18]，有一群mRNA分子滯留在核內(nèi)，在熒光顯微鏡水平，它們出現(xiàn)不規(guī)則的點狀結(jié)構(gòu)，大小和形狀不同，當用電子顯微鏡檢查時，它們被看作是集群染色質(zhì)顆粒，該類mRNA分子在結(jié)構(gòu)上被命名為核斑（nuclear speck?le）。Billy等[19]將GFP融合表達PSF并結(jié)合激光共聚焦實驗，確定了參與該蛋白在細胞核和亞核分布的序列。如同其他剪接因子，PSF定位于除核仁以外的細胞核，并呈現(xiàn)出核斑結(jié)構(gòu)。PSF包含N端富含谷氨酸、谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域，2個RRM結(jié)構(gòu)域，以及含有核定位信號的C端結(jié)構(gòu)域，上述因素使PSF完全定位于細胞核中。而RRM2結(jié)構(gòu)域缺失可以導(dǎo)致核斑現(xiàn)象消失，PSF彌散分布于細胞核中。表明RRM結(jié)構(gòu)域參與PSF以核斑形式分布在細胞核。此外已明確，在一些基因中，RRM結(jié)構(gòu)域相當于核定位信號（nuclear location signal，NLS）的作用，如錐形蟲中TcUBP1的RRM結(jié)構(gòu)域，酵母中Lhp1p和Pab1p基因的RRM3和RRM4的部分序列，哺乳動物TIA-1、TIAR、PABPC1 等 基 因 的 RRM2 序 列[2]。 此外，RRM結(jié)構(gòu)域也可以介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用[20]。因此，含RRM的RBP可以發(fā)揮多樣生物學(xué)功能。綜上，我們構(gòu)建了不同剪接體及RRM缺失結(jié)構(gòu)域重組質(zhì)粒，有助于深入研究RRM在RBPMS發(fā)揮功能方面的作用。

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