藥用野生稻體細(xì)胞雜交后代對條紋葉枯病的抗性鑒定

董巖 ，錢長根 ，張維林 ，馬榮榮 ，羊健 ，張恒木 ，嚴(yán)成其 ，陳劍平

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 嘉興 314036；3.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院，浙江 金華 321000；4.浙江省寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040；5.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部植物保護(hù)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310021

水稻條紋葉枯?。╮ice stripe disease）是由水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）引起的一種危害嚴(yán)重的水稻病毒病，通過灰飛虱（Laodelphax striatel?lus Fallén）刺吸以持久方式傳播[1-2]，具有暴發(fā)性、遷移性和間歇性等特性，屬可防難治的病毒病害，一旦發(fā)生難以控制[3]。早期發(fā)病株的葉心呈現(xiàn)黃色條紋，葉片柔軟下垂，常伴有植株矮化、分蘗減少等特征；在水稻分蘗盛期前發(fā)病的植株葉片卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀；后期發(fā)病葉片上呈現(xiàn)黃色條紋，抽穗不良或畸形，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量與品質(zhì)[4-5]。由于感病粳稻品種大面積推廣，20世紀(jì)90年代曾在江蘇發(fā)生，隨后蔓延到整個長江中下游的各稻區(qū)，并迅速成為該稻區(qū)水稻生產(chǎn)中的主要病害之一[6]。2004年在江蘇省的42個縣都有條紋葉枯病發(fā)生，獲病面積達(dá)157萬公頃，占水稻栽培面積的79%，絕收面積達(dá)5200公頃，給水稻生產(chǎn)帶來巨大損失[7]。

野生稻是一種重要的天然基因庫，攜帶對各種病蟲害和非生物逆境的抗（耐）性基因[8-10]。我們前期的研究結(jié)果表明，藥用野生稻對灰飛虱具有很強(qiáng)的抗性和排驅(qū)性。由于分屬不同的種，藥用野生稻（CC染色體組，2n=24）與栽培稻（AA染色體組，2n=24）難以以常規(guī)雜交方法獲得后代。課題組采用原生質(zhì)體不對稱體細(xì)胞雜交將藥用野生稻高抗灰飛虱基因轉(zhuǎn)移到栽培稻。研究表明，在許多水稻品種中，抗灰飛虱特性與抗條紋葉枯病特性密切相關(guān)，有些品種的這2種抗性相關(guān)系數(shù)高達(dá)99%以上，說明這些水稻品種的抗灰飛虱基因與抗條紋病毒基因可能是連鎖的[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12-14]，預(yù)防條紋葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效且符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)綠色發(fā)展要求的方法是篩選抗病資源，培育和推廣抗病品種。為此，本實(shí)驗(yàn)的目的旨在從藥用野生稻后代中篩選抗條紋葉枯病材料，為水稻條紋葉枯病抗病品種的選育和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用野生稻與栽培稻02428通過體細(xì)胞雜交，獲得149份雜交后代，并從中篩選出1個對條紋葉枯病表現(xiàn)高抗的水稻材料Pf5-5；Pf5-5與9311雜交獲得110份F1個體，實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)選取34份F1個體作為供試材料。武育粳3號為感病對照，孫戴珍[1]等已經(jīng)報道的具有抗條紋葉枯病特性的Kasalath為抗病對照品種。

帶毒灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，在感病材料武育粳3號上飼養(yǎng)。參照周益軍[15]等的方法飼養(yǎng)，用ELISA[16]技術(shù)檢測灰飛虱帶毒情況，篩選帶毒率大于50%的群體定為傳毒群體。

1.2 苗期接毒鑒定

將親本F1及抗感對照播種于2000 mL燒杯中，每杯40株稻苗，每份材料播種4份，保證有足夠的供試株數(shù)。待水稻苗長至三葉期時接毒，放蟲前剔除病弱苗，保證有30株生長一致的稻苗，蓋好紗布用于接蟲鑒定?？剐约墑e參照Washio[17]等的方法：0級，無癥狀；1級，病葉不卷曲，有輕微黃綠色斑駁，植株生長正常；2級，病葉上有黃綠色或黃白色條斑，病葉卷曲或輕微卷曲，植株生長基本正常；3級，葉片嚴(yán)重失綠，病葉卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，少數(shù)葉片黃化枯萎；4級，多數(shù)葉片卷曲呈捻轉(zhuǎn)狀，病葉黃化枯死，植株呈假枯心狀或整株枯死。根據(jù)周彤[15]對水稻條紋葉枯病鑒定方法的研究，設(shè)定接蟲時間為48 h，接種蟲量為4頭/株，蟲齡為2～4齡。為確保供試稻苗均勻獲毒，每天早、中、晚各手動趕蟲1次。接蟲48 h后清除所有灰飛虱，并移栽到網(wǎng)室的田塊內(nèi)。接蟲7 d后調(diào)查病害情況，每隔7 d調(diào)查一次，共調(diào)查4次。

0～1級記為抗病，2～4級記為發(fā)病，計算發(fā)病率，然后根據(jù)發(fā)病率進(jìn)行抗性評價?？剐栽u價參照周益軍[15]等制定的標(biāo)準(zhǔn)并略加改動：免疫（I），發(fā)病率為0；高抗（HR），發(fā)病率0～5%；抗?。≧），發(fā)病率5.1%～15%；中抗（MR），發(fā)病率15.1%～30%；感病（S），發(fā)病率30.1%～50%；高感（HS），發(fā)病率大于50.1%。

1.3 ELISA技術(shù)檢測水稻感病率

稻苗三葉期接毒，接毒方法同上，接毒48 h后驅(qū)趕全部灰飛虱，7 d后采集樣品用于ELISA[16]，檢測供試水稻品種感病率，鑒定株數(shù)為70株。

感病率（%）=感病株數(shù)/鑒定株數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 親本在田間的抗感表現(xiàn)

如表1所示，感病對照武育粳3號平均發(fā)病率為67.5%，同時在ELISA檢測中，武育粳3號的感病率為78.6%，表現(xiàn)為高感；抗病對照Kasalath的平均發(fā)病率為2.1%，感病率為5.7%，表現(xiàn)為高抗，表明本次試驗(yàn)結(jié)果可靠。藥用野生稻體細(xì)胞雜交后代Pf5-5的平均發(fā)病率為3.2%，感病率為4.2%，表現(xiàn)高抗；栽培稻9311的平均發(fā)病率為63.6%，感病率為68.6%，表現(xiàn)高感。

2.2 F1個體表型鑒定

如表2所示，34份F1個體中，Y35、Y37、Y39、Y42和Y45的發(fā)病率分別為4.6%、2.9%、2.7%、2.2%和4.2%，表現(xiàn)高抗；其余29份材料的發(fā)病率為5.6%～14.4%，表現(xiàn)抗條紋葉枯病。

表1 親本（9311/Pf5-5）抗條紋葉枯病的田間抗性表現(xiàn)

表2 F1水稻材料對條紋葉枯病的抗性評價

2.3 ELISA檢測F1個體的感病率

感病率檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Y35、Y37、Y39、Y42和Y45的感病率分別為7.1%、5.7%、5.7%、5.7%和4.3%。Y45的感病率高于抗病對照Kasalath，Y37、Y39和Y42的感病率與Kasalath相同，表明這4個材料高抗水稻條紋葉枯病。Y35的感病率略低于Kasalath，表明抗水稻條紋葉枯病。Y6、Y13、Y14、Y51、Y56、Y62和Y75的感病率為11.4%～14.3%，表現(xiàn)抗條紋葉枯病。剩余22份材料的感病率為15.7%～30.0%，表現(xiàn)對條紋葉枯病中抗。見表3。

表3 F1個體感病率檢測

3 討論

Y37、Y39、Y42和Y45的表型鑒定試驗(yàn)和檢測感病率試驗(yàn)結(jié)果一致，都表現(xiàn)為高抗條紋葉枯病。Y6、Y13、Y14、Y51、Y56、Y62和Y75的表型鑒定試驗(yàn)和檢測感病率試驗(yàn)結(jié)果一致，都表現(xiàn)抗條紋葉枯病

Y35在表型評價中的抗性級別為高抗，而在ELISA檢測帶毒率試驗(yàn)中表現(xiàn)抗條紋葉枯?。黄溆?2份水稻材料在ELISA檢測帶毒率試驗(yàn)中表現(xiàn)對條紋葉枯病中抗，而在表型評價中的抗性級別為抗條紋葉枯病。比較2項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)每個材料的感病率都略高于它們的發(fā)病率，分析其原因可能是在調(diào)查表型時病癥表現(xiàn)不明顯，或者這些材料對水稻條紋葉枯病病毒的忍耐性。如果表型病害級別和材料的感病率不一致，我們以較嚴(yán)重的得病指標(biāo)作為抗病篩選的標(biāo)準(zhǔn)，這樣篩選出的結(jié)果可靠性高。所以將Y35作為抗性材料，其余22份水稻材料確定為中抗材料。

[1]孫戴珍,江鈴,張迎信.8個水稻品種的條紋葉枯病抗性特征[J].中國水稻科學(xué),2006,20(2):219-222.

[2]Nemoto H,Ishikawa K,Shimura E.The resistance to rice stripe virus and small brown planthopper in rice variety,Ir50[J].Breeding Sci,1994,44:13-18.

[3]王華弟,陳劍平,朱黎明,等.水稻條紋葉枯病的為害損失及防治指標(biāo)[J].中國水稻科學(xué),2008,22(2):203-207.

[4]阮義理.日本水稻條紋葉枯病的研究進(jìn)展[J].國外農(nóng)學(xué)(水稻),1986,(5):25-28.

[5]朱鳳美,肖慶璞,王法明.江南稻區(qū)新發(fā)生的幾種稻病[J].植物保護(hù)學(xué)報,1964,2(3):100-102.

[6]江蘇省水稻條紋葉枯病協(xié)作攻關(guān)課題組.江蘇省水稻條紋葉枯病協(xié)作攻關(guān)研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,(增刊):1-2.

[7]周彤,周益軍,程兆榜.粳稻品種對水稻條紋葉枯病的抗性鑒定及抗病品種鎮(zhèn)稻88的遺傳分析[J].植物保護(hù)學(xué)報,2007,34(5):475-479.

[8]王金英,江川.野生稻資源研究及其在水稻育種上利用現(xiàn)狀[J].福建稻麥科技,2005,23(2):1-4.

[9]謝建坤,孔祥禮,包勁松,等.水稻野生種質(zhì)優(yōu)異基因分子標(biāo)記定位和利用的研究進(jìn)展[J].遺傳,2004,26(1):115-121.

[10]楊仁崔.IRRI野生稻種質(zhì)資源應(yīng)用研究[J].世界農(nóng)業(yè),1997,(4):20-22.

[11]林含新,林奇田,謝聯(lián)輝,等.水稻品種對水稻條紋病毒及其介體灰飛虱的抗性鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,29(4):453-458.

[12]程兆榜,楊榮明,周益軍.關(guān)于水稻條紋葉枯病大發(fā)生年的表現(xiàn)及應(yīng)用建議[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,(增刊):3-5.

[13]高泰東,花文杰,袁德銀.抗病品種在水稻條紋葉枯病防治策略的思考[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(1):61-63.

[14]程兆榜,刁春友,楊榮明.水稻條紋葉枯病綜合防治方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,(2):41-42.

[15]周彤,范永堅,周益軍,等.水稻條紋葉枯病鑒定方法的研究[J].植物保護(hù)學(xué)報,2008,34(6):77-79.

[16]陸家鈺,張成良,張作芳,等.A蛋白酶聯(lián)免疫法檢測植物病毒的研究[J].植物檢疫,1990,4(3):161-163.

[17]Washio O,Ezuka A,Sakurgi Y,et al.Studies on the breed?ing of rice varieties resistant to stripe disease:I.Varietal dif?ference in resistance to rice stripe disease[J].Jpn J Breeding,1967,17(2):91-97.