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    HPT-mCherry融合標(biāo)簽在水稻轉(zhuǎn)基因篩選鑒定中的應(yīng)用

    2013-10-29 09:36:26陳娟周潔嚴(yán)成其王栩鳴楊勇余初浪程曄陳劍平
    生物技術(shù)通訊 2013年5期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒標(biāo)簽

    陳娟 ,周潔 ,嚴(yán)成其 ,王栩鳴 ,楊勇 ,余初浪 ,程曄 ,陳劍平

    1.浙江師范大學(xué) 生化學(xué)院,浙江 金華 321000;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,農(nóng)業(yè)部植物保護(hù)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省植物病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021

    農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用生物學(xué)手段將目的基因?qū)胨净蚪M中的重要方法,主要用于水稻性狀的改良和基因功能的研究[1-2]。自1994年Hiei等建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化體系以來(lái)[3],水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展。水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)需要借助標(biāo)記基因來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子,實(shí)驗(yàn)中常用的標(biāo)記基因分為兩類(lèi),即選擇基因和報(bào)告基因[4]。目前常用選擇基因?qū)D(zhuǎn)化的材料進(jìn)行較為高效的篩選,并利用其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行輔助篩選。常用的選擇基因包括潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hygromycin phosphotransferase gene,HPT)[5]和抗除草劑基因(bi?alaphos resistance gene,bar)[6]等。使用潮霉素篩選抗性愈傷,可能篩選得到假陽(yáng)性的愈傷組織,往往需要借助PCR等方法檢測(cè)進(jìn)行輔助鑒定,而這些方法通常都比較耗時(shí)費(fèi)力。為了提高輔助篩選的效率,目前很多研究選用報(bào)告基因進(jìn)行輔助篩選。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的酶或蛋白質(zhì)的基因,例如β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene,gus)和熒光蛋白基因等[7-8]。gus通過(guò)編碼β-葡萄糖苷酸酶將底物水解為藍(lán)色產(chǎn)物,可進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè),但檢測(cè)過(guò)程中需要破壞植物組織,限制了其在活體中的應(yīng)用[9]。相比gus基因,熒光蛋白基因的檢測(cè)較為簡(jiǎn)便,被廣泛使用。

    雖然報(bào)告基因的輔助篩選是一種比較經(jīng)濟(jì)有效的方式,但還是存在一些無(wú)法避免的缺陷。最主要的缺陷就是報(bào)告基因需要額外的啟動(dòng)子和終止子來(lái)控制其表達(dá)。啟動(dòng)子和終止子是控制基因表達(dá)的重要元件[4],而轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中常用啟動(dòng)子和終止子數(shù)量有限,重復(fù)使用相同的啟動(dòng)子或終止子,會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)生遺傳重組,存在一定的風(fēng)險(xiǎn)[4,10]。以植物轉(zhuǎn)基因中常用的CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動(dòng)子為例,該啟動(dòng)子可以在植物體內(nèi)保持較高水平的表達(dá),但該啟動(dòng)子內(nèi)含有一個(gè)重組熱點(diǎn)(TATA box),會(huì)使轉(zhuǎn)基因不穩(wěn)定,發(fā)生遺傳重組[11]。此外,使用多個(gè)啟動(dòng)子和終止子會(huì)占用多個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn),使得構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體時(shí)策略設(shè)計(jì)更為復(fù)雜。在本研究中,我們嘗試使用HPT-mCherry融合蛋白標(biāo)簽,利用HPT和mCherry篩選轉(zhuǎn)基因材料。mCherry是由DsRed突變得到的單體紅色熒光蛋白,在587 nm激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光,可以排除葉綠素的干擾[12-14]。利用潮霉素篩選陽(yáng)性愈傷,并使用熒光顯微鏡觀(guān)察愈傷組織和植株,操作簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確率較高,可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

    我們構(gòu)建了HPT-mCherry融合標(biāo)簽,用單一的融合蛋白同時(shí)實(shí)現(xiàn)篩選基因和報(bào)告基因的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HPT-mCherry融合標(biāo)簽?zāi)苡行У睾Y選陽(yáng)性愈傷,鑒定得到陽(yáng)性植株。

    1 材料及方法

    1.1 材料

    日本晴水稻(Oryza sativa L.spp.japonica cv.Nipponbare)、根 瘤 農(nóng) 桿 菌(Agrobacterium tumefa?ciens)EHA105均為本實(shí)驗(yàn)室保存;TRIzol試劑(Invit?rogen公司);iScriptcDNA合成試劑盒、SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒、(Bio-Rad公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司);LightCycler 480定量PCR儀(Roche公司);NanoVue紫外分光光度計(jì)(GE公司);熒光體式顯微鏡(Leica公司);燈式熒光檢測(cè)器(BLS公司,匈牙利)。

    1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

    本研究中的相關(guān)載體骨架來(lái)自pCAMBIA1300(Canberra公司,澳大利亞)。p1300URF載體(圖1B)攜帶CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HPT-mCherry融合基因。實(shí)驗(yàn)中以p1300UR-mC載體(圖1C)作為陽(yáng)性對(duì)照,攜帶Ubiqitin啟動(dòng)子(玉米泛素基因啟動(dòng)子)[15]驅(qū)動(dòng)的mCherry基因和CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HPT基因。

    為了構(gòu)建包含HPT-mCherry融合標(biāo)簽的p1300URF載體,通過(guò)序列分析,使得標(biāo)記基因HPT和mCherry通過(guò)一個(gè)短的多聚甘氨酸鏈相連,得到融合片段。該片段包括3個(gè)小片段,片段1包含部分HPT基因和Link序列,片段2包含mCherry基因和Link序列,片段3包含載體的部分序列。首先用引物P1和P2擴(kuò)增片段1、P3和P4擴(kuò)增片段2、P5和P6擴(kuò)增片段3,然后將上述PCR產(chǎn)物稀釋至1/100后作為模板,用引物P1和P6通過(guò)融合PCR技術(shù)[16]合成完整的改造片段。采用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,用RsrⅡ和SacⅡ酶切,將酶切片段連入經(jīng)相同的內(nèi)切酶酶切的目標(biāo)載體pCAMBIA1300UR,熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌,篩選正確克隆,保菌備用。引物及序列見(jiàn)表1。

    1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化

    挑選飽滿(mǎn)的種子,去殼后置于50 mL無(wú)菌離心管中,用無(wú)菌水清洗1次;加入30 mL 75%乙醇消毒1 min;棄乙醇,用無(wú)菌水清洗后,加入30 mL次氯酸鈉(活性氯濃度為1.25%),攪拌后靜置30 min;棄次氯酸鈉,用無(wú)菌水清洗3次,轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基[17]中,28℃培養(yǎng)至得到愈傷顆粒。

    將含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌懸浮于A(yíng)AM培養(yǎng)液(D600nm=0.08~0.1)中,挑取誘導(dǎo)得到的水稻愈傷組織,置菌液中侵染15 min;棄上清,超凈臺(tái)中晾30~40 min;棄菌懸液,將愈傷組織置于共培養(yǎng)基[18]上,20℃暗培養(yǎng)3 d;用無(wú)菌水清洗愈傷組織5~6次,轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基[18]上光照培養(yǎng)20 d,用Leica熒光顯微鏡檢測(cè)帶有紅色熒光的愈傷組織,并將其轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇,直到顆粒性的抗性愈傷組織長(zhǎng)出;挑取抗性愈傷移入分化培養(yǎng)基[18]中,28℃培養(yǎng)至分化成苗。

    1.4 轉(zhuǎn)基因材料的鑒定

    水稻轉(zhuǎn)基因材料DNA的提取參考CTAB小量提取法[19]。用引物HPT-FL-F/HPT-FL-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR條件:95℃ 10 min;95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s,35個(gè)循環(huán)。

    1.5 轉(zhuǎn)基因水稻熒光檢測(cè)

    用Leica熒光體式顯微鏡和BLS燈式熒光檢測(cè)器觀(guān)察轉(zhuǎn)化愈傷組織及轉(zhuǎn)化植株的紅色熒光。

    表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列

    1.6 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR

    取100 mg水稻樣品置于預(yù)冷的研缽中,用液氮充分研磨,加入1 mL TRIzol試劑繼續(xù)研磨至粉末,按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取水稻總RNA,最后加入20~40 μL無(wú)RNase的水溶解RNA沉淀。用iScript cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA。

    1.7 熒光定量PCR檢測(cè)

    用質(zhì)粒提取試劑盒提取p1300URF質(zhì)粒,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)粒濃度測(cè)量,并按下式計(jì)算質(zhì)粒摩爾濃度[20]:

    將質(zhì)粒p1300URF進(jìn)行1/10梯度稀釋?zhuān)謩e稀釋為 105、106、107、108、109、1010和 1011copies/μL 共 7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,作為模板;以mCherry-RT-F/mCherry-RT-R和HPT-RT-F/HPT-RT-R為引物,采用SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR(PCR 條 件 :94℃ 3 min;94℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)),然后根據(jù)7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值計(jì)算模板起始濃度,并以模板起始濃度為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[21]。

    2 結(jié)果

    2.1 利用融合標(biāo)簽有效篩選陽(yáng)性愈傷

    將包含p1300URF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌與粳稻品種日本晴的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng),3 d后選擇培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中使用包含p1300UR-mC質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)選擇20 d的愈傷組織進(jìn)行觀(guān)察,結(jié)果顯示,成功轉(zhuǎn)化的愈傷組織在515~588 nm激發(fā)光照射下發(fā)出紅色熒光,轉(zhuǎn)p1300URF愈傷組織的熒光強(qiáng)度較弱,但不影響mCherry作為報(bào)告基因篩選陽(yáng)性愈傷組織的功能(圖2A~D)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì),p1300UR-mC和p1300URF分別轉(zhuǎn)化了306塊和301塊胚性愈傷組織,通過(guò)兩輪潮霉素篩選,分別獲得259塊和204塊獨(dú)立轉(zhuǎn)化的表達(dá)紅色熒光的抗性愈傷組織,轉(zhuǎn)化效率分別為84.6%和67.8%。上述結(jié)果表明,HPT與mCherry融合后,轉(zhuǎn)化效率雖然有所降低,HPT-mCherry融合標(biāo)簽中的HPT基因仍然可以有效篩選陽(yáng)性愈傷。結(jié)合熒光觀(guān)察,對(duì)照組和融合標(biāo)簽組都能進(jìn)一步快速篩選陽(yáng)性愈傷。

    圖1 p1300UR(A)、p1300URF(B)和p1300UR-mC(C)載體圖

    圖2 轉(zhuǎn)基因水稻熒光檢測(cè)

    2.2 利用融合標(biāo)簽鑒定轉(zhuǎn)基因植株

    對(duì)7 d苗齡的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行熒光檢測(cè)(圖2E、F),陽(yáng)性對(duì)照的根、芽和莖均有較強(qiáng)的紅色熒光,雖然受融合的HPT基因影響,轉(zhuǎn)p1300URF的植株熒光強(qiáng)度較弱,但紅色熒光仍然可以清晰地區(qū)分轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化植株。為進(jìn)一步驗(yàn)證融合標(biāo)簽熒光輔助篩選的有效性,我們隨機(jī)選取轉(zhuǎn)了14株轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測(cè),各陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增得到1023 bp的片段(圖3),與通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察紅色熒光的檢測(cè)結(jié)果完全一致,說(shuō)明HPT-mCherry融合標(biāo)簽在轉(zhuǎn)基因鑒定中能夠替代常用PCR檢測(cè)方法,從而大量節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和相關(guān)耗材。上述結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)基因植株中,HPT與mCherry融合后相互間影響較小,可以正常用于轉(zhuǎn)基因植株鑒定。

    2.3 HPT和mCherry基因在mRNA水平上的表達(dá)分析

    將濃度為105ng/μL(即 1.58×1013copies/μL)的質(zhì)粒 p1300URF分別稀釋至 105、106、107、108、109、1010和1011copies/μL作為模板,制作HPT和mCherry基因擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到HPT和mCherry標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.996。提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性愈傷和植株的總RNA進(jìn)行qRT-PCR,通過(guò)絕對(duì)定量PCR分析,得到各株系中HPT和mCherry的表達(dá)量分別為107.06和107.81copies/μL。從mRNA水平證明采用融合標(biāo)簽后,mCherry和HPT能在轉(zhuǎn)基因愈傷和植株中高效表達(dá)。參見(jiàn)圖4。

    圖3 轉(zhuǎn)p1300URF的水稻植株HPT基因的PCR檢測(cè)

    圖4 轉(zhuǎn)基因材料的絕對(duì)定量PCR分析

    3 討論

    隨著水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟,轉(zhuǎn)化頻率不再是T-DNA轉(zhuǎn)化的主要限制因素。在水稻轉(zhuǎn)基因研究中,轉(zhuǎn)基因后代的鑒定和遺傳分析主要利用潮霉素抗性基因的PCR或GUS酶活性進(jìn)行檢測(cè),但這些方法工作量大,比較費(fèi)時(shí)。mCherry是一個(gè)單體熒光蛋白,其波長(zhǎng)較長(zhǎng)(587/610 nm),成熟時(shí)間較短(t1/2≈0.25 h),在融合外源蛋白時(shí)受影響較少[22]。我們構(gòu)建了HPT-mCherry融合標(biāo)簽載體,并確認(rèn)了融合蛋白能有效發(fā)揮抗性基因功能,行使抗潮霉素的功能,也能有效地產(chǎn)生紅色熒光,從而實(shí)現(xiàn)可視化篩選。

    用HPT-mCherry融合標(biāo)簽進(jìn)行鑒定,在避免了繁雜工作的同時(shí)保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。而且,該方法還避免了使用2套啟動(dòng)子和終止子分別控制HPT和mCherry的表達(dá),有效減少了遺傳重組的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)避免了占用大量限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn),方便了載體的進(jìn)一步使用。

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