• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同時(shí)間電刺激對(duì)C2C12細(xì)胞糖代謝的影響研究

    2013-10-28 02:28:07徐曉陽(yáng)閆旭杰潘紅英趙秀峰
    關(guān)鍵詞:肌管糖原骨骼肌

    徐曉陽(yáng), 閆旭杰, 周 周, 潘紅英, 趙秀峰

    (華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510631)

    不同時(shí)間電刺激對(duì)C2C12細(xì)胞糖代謝的影響研究

    徐曉陽(yáng)*, 閆旭杰, 周 周, 潘紅英, 趙秀峰

    (華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510631)

    以小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)肌管為研究對(duì)象,測(cè)定不同時(shí)間電刺激對(duì)其AMPK、HK-Ⅱ、GS-1基因表達(dá)、GLUT4基因及蛋白表達(dá)等糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)指標(biāo)的變化,探討不同收縮時(shí)間對(duì)骨骼肌細(xì)胞糖代謝的影響及機(jī)制. 骨骼肌細(xì)胞的肌糖原消耗隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加,為了保證骨骼肌細(xì)胞糖消耗的需要,通過(guò)AMPK信號(hào)通路的調(diào)控,其膜對(duì)胞外糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力會(huì)隨收縮時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng);骨骼肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶的合成則隨肌糖原儲(chǔ)量的持續(xù)下降而增加.

    骨骼肌細(xì)胞; 電刺激; 糖代謝; 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

    糖是骨骼肌細(xì)胞收縮的重要能量來(lái)源,多數(shù)運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的完成都離不開糖供能,而體內(nèi)糖供能的能力則決定了運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)成績(jī). 因此,糖的大量消耗也是導(dǎo)致這些運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要原因[1]. 骨骼肌細(xì)胞收縮將引起胞內(nèi)糖原的大量消耗[2].但對(duì)骨骼肌細(xì)胞在收縮過(guò)程中糖原消耗調(diào)控機(jī)制的信號(hào)傳導(dǎo), 以及肌糖元消耗和合成平衡調(diào)控的機(jī)制不清楚. 在體研究干擾因素多, 取材周期長(zhǎng), 對(duì)研究結(jié)果有一定的影響.本文利用小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)作為研究對(duì)象,研究不同時(shí)間電刺激對(duì)其中糖原含量、AMPKα1和α2、HKⅡ GS-1mRNA的表達(dá)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4(GLUT4)mRNA的表達(dá)及其蛋白含量的變化.

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    研究用小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12),由南方醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室提供. 培養(yǎng)基為10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基(DMEM),置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中,細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)70%~80%時(shí),采用0.25%胰蛋白酶消化,以2×105/mL的細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)入直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中,細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底時(shí),將培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基,每48 h換液1次,分化5 d后進(jìn)行后續(xù)研究.

    培養(yǎng)所用各試劑均購(gòu)自Hyclone公司.

    1.2 分組及電刺激方式

    將培養(yǎng)細(xì)胞分為對(duì)照組(C組)、電刺激60 min組(E60組)、電刺激120 min組(E120). 用美國(guó)GRASS公司生產(chǎn)的S48 雙向脈沖電刺激器進(jìn)行電刺激,設(shè)定電壓15 V,頻率3 Hz,脈寬30 ms. 刺激結(jié)束后,即刻收樣,測(cè)定各指標(biāo).

    1.3 指標(biāo)的測(cè)定

    1.3.1 糖原含量的測(cè)定 肌管糖原含量用南京建成肌糖原及肝糖原蒽酮法測(cè)定試劑盒測(cè)定.

    1.3.2 GLUT4蛋白含量的測(cè)定 GLUT4蛋白含量的測(cè)定采用武漢優(yōu)爾生公司的小鼠GLUT4酶聯(lián)免疫分析試劑盒測(cè)定,各指標(biāo)監(jiān)測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作. 用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GLUT4蛋白含量.

    1.3.3AMPKα1和α2、HKⅡ、GS-1、GLUT4mRNA表達(dá)的測(cè)定 研究所涉及的各基因表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定.

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

    應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理. 各數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,以方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著性,P<0.01為差異具極顯著性.

    2 結(jié)果與分析

    2.1糖原含量的變化

    表1說(shuō)明:電刺激60 min時(shí)C2C12肌管中糖原略高于對(duì)照組(P>0.05),電刺激120 min時(shí)肌管中糖原顯著降低(P<0.05).

    表1 不同時(shí)間電刺激肌管糖原含量的變化

    研究表明:強(qiáng)度在75%VO2max(最大攝氧量,Maximal oxygen consumption)以上的運(yùn)動(dòng)中糖供能可占到總能耗的70%~80%;持續(xù)時(shí)間超過(guò)60~90 min的50%~80%VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng),肌糖原儲(chǔ)量將是運(yùn)動(dòng)能力的限制因素[1]. 離體研究證明了肌細(xì)胞收縮時(shí)糖耗量增加. MAROTTA等[2]以50 V、30 ms、3 Hz電刺激C2C12肌管,90 min后觀察到肌管中糖原分解增加,糖原代謝相關(guān)酶活性改變,電刺激60 min時(shí)糖原含量略高于對(duì)照組(表1),其原因?yàn)椋菏湛s時(shí)肌細(xì)胞不僅依靠肌糖原的儲(chǔ)備,肌肉還大量吸收培養(yǎng)液中的糖來(lái)滿足能量供應(yīng). 這與運(yùn)動(dòng)時(shí)人體骨骼肌細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)開始階段吸收和利用血糖的速度上升,隨著運(yùn)動(dòng)的進(jìn)行,血糖的吸收和利用速度仍保持上升趨勢(shì)的情況相似,體外實(shí)驗(yàn)中收縮可明顯升高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[3]. 但刺激時(shí)間延長(zhǎng)到120 min時(shí),肌管中糖原含量出現(xiàn)了明顯下降. 說(shuō)明即使環(huán)境中有可攝取的糖,肌管還是會(huì)大量消耗自身儲(chǔ)備的肌糖原.

    2.2AMPK基因表達(dá)的變化

    電刺激可以改變C2C12肌管AMPK-α1mRNA與AMPK-α2mRNA的表達(dá)(表2). 當(dāng)刺激60 min時(shí),二者的相對(duì)表達(dá)率均明顯升高,刺激120 min時(shí),AMPK-α1mRNA的相對(duì)表達(dá)率仍明顯高于對(duì)照(P<0.01),而AMPK-α2mRNA的相對(duì)表達(dá)率雖高于對(duì)照,但差異已不顯著(P>0.05).

    表2 電刺激不同時(shí)間肌管內(nèi)AMPK-α1、2mRNA相對(duì)表達(dá)率

    注:*表示與C組比較有顯著性差異(P<0.05);**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

    活細(xì)胞內(nèi)ATP合成和水解之間是動(dòng)態(tài)平衡的,絕大多數(shù)細(xì)胞的ATP/ADP比值都保持在小波動(dòng)范圍(10∶1). 運(yùn)動(dòng)引起肌肉內(nèi)糖原和ATP消耗增多使得ATP/ADP比值下降,AMP大幅上升,并通過(guò)與AMPK-γ亞基相結(jié)合激活A(yù)MPK[4-5],高濃度的ATP可拮抗這一過(guò)程.AMPK被激活后,上調(diào)ATP的合成過(guò)程,運(yùn)動(dòng)應(yīng)激可能先激活A(yù)MPK的α2亞型. 鼠和人骨骼肌內(nèi),高糖原濃度可抑制AMPK的激活,說(shuō)明AMPK不僅可以調(diào)節(jié)ATP的合成,還可感知細(xì)胞中能量的儲(chǔ)存狀況.AMPK-β上的糖原綁定域(GBD)在能量?jī)?chǔ)存感知過(guò)程中發(fā)揮重要作用. GBD的另外一個(gè)作用是促進(jìn)糖原合成酶與其底物相結(jié)合[6],加速糖原的合成. 研究證明,體外電刺激糖尿病大鼠骨骼肌可以明顯增加肌內(nèi)磷酸化AMPK蛋白含量及其磷酸化程度(p-AMPK/AMPK),但AMPK蛋白含量則無(wú)變化[7].

    并非所有運(yùn)動(dòng)都可激活A(yù)MPK信號(hào)通路,運(yùn)動(dòng)是否激活該通路,與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān). FUJII等[8]讓受試以70%VO2max強(qiáng)度在功率自行車上運(yùn)動(dòng)60 min,分別于運(yùn)動(dòng)的20、60 min以及運(yùn)動(dòng)結(jié)束后的30 min時(shí)對(duì)股外側(cè)肌進(jìn)行活檢,觀察到AMPK-α2表達(dá)在運(yùn)動(dòng)20、60 min時(shí)顯著升高,運(yùn)動(dòng)后30 min依然保持高水平. CHEN等[9]發(fā)現(xiàn):受試分別進(jìn)行40%、60%和80%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),AMPK-α2的表達(dá)在60%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)上升,80%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)上升明顯. WOJTASZEWSKI等[10]讓受試以90%VO2max的強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)5 min后,強(qiáng)度降為55%VO2max持續(xù)運(yùn)動(dòng)55 min,股外側(cè)肌活檢發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻AMPK-α2的活性升高了3~4倍,3 h后才恢復(fù)至安靜水平. DERAVE等[11]對(duì)2 h游泳運(yùn)動(dòng)后18~24 h的大鼠分灌胃糖溶液和水,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其快肌中AMPK和葡萄糖載體均明顯增多. SEAN等[12]觀察到人體60 min、70%VO2max強(qiáng)度的自行車運(yùn)動(dòng)可以使肌細(xì)胞內(nèi)AMPK-α2蛋白含量增加2倍. 離體研究也證明:使孵育大鼠骨骼肌收縮、處于缺氧和高滲透壓環(huán)境等都可同時(shí)增加AMPK-α1、α2亞型的活性[13].

    由表2可知,電刺激C2C12肌管60、120 min時(shí),E60和E120組的AMPK-α2的基因表達(dá)均升高,其中電刺激60 min 組有顯著性升高(P<0.05),但刺激時(shí)間達(dá)120 min時(shí)其表達(dá)雖高于對(duì)照,差異卻不明顯(P>0.05),說(shuō)明AMPK-α2的激活有時(shí)間依賴性,并不會(huì)隨著時(shí)間的延續(xù)而持續(xù)升高.

    AMPK的α2亞基主要在骨骼肌、心肌和肝臟中含量最高.在AMP刺激下,α2活性提高的幅度大于α1的活性[14]. 有研究發(fā)現(xiàn):在某些因素刺激下,AMPK活性的2個(gè)主要催化亞基α1和α2的變化并不一致[15]. 如3周單腿伸展耐力訓(xùn)練使訓(xùn)練腿的AMPK-α1、α2活性分別增加94%和49%[16]. 本文刺激60 min時(shí),C2C12肌管AMPK-α1、α2表達(dá)均明顯上升,α1上升的幅度更大,而當(dāng)刺激時(shí)間達(dá)120 min時(shí),二者的表達(dá)雖高于對(duì)照,但只有α2的差異顯著(P<0.01),這與其他研究者發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致. 隨著收縮時(shí)間的延長(zhǎng),非骨骼肌細(xì)胞特異性的AMPK系統(tǒng)被激活,從更大的范圍調(diào)控機(jī)體能量平衡進(jìn)行. 因此,α1亞基對(duì)骨骼肌細(xì)胞能量平衡的調(diào)節(jié)作用可能較α2亞基更為持久. 同時(shí),骨骼肌細(xì)胞能量平衡還有其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與調(diào)控[17],收縮也會(huì)啟動(dòng)非骨骼肌特異的AMPK途徑[18]. 本研究中刺激120 min時(shí)AMPK-α2mRNA表達(dá)沒(méi)有持續(xù)上調(diào),驗(yàn)證了上述觀點(diǎn).

    2.3GLUT4基因表達(dá)和蛋白含量的變化

    電刺激60、120 min時(shí),GLUT4 mRNA表達(dá)明顯增加(表3),2個(gè)時(shí)間點(diǎn)C2C12肌管中GLUT4蛋白含量也均極明顯增加(P<0.01).

    表3不同時(shí)間電刺激肌管內(nèi)GLUT4 mRNA和蛋白含量的變化

    Table 3 Contents of GLUT4 and GLUT4 mRNA in C2C12 after electrical stimulation

    注:*表示與C組比較有顯著性差異(P<0.05);**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

    有研究[19]認(rèn)為:GLUT4基因的開放和關(guān)閉主要受控于GLUT4基因啟動(dòng)子上游元件與MEF-2的相互作用.AMPK和CaMK可使轉(zhuǎn)錄抑制因子(HDACs)磷酸化,并從MEF2結(jié)合位點(diǎn)解離,增加GLUT4基因表達(dá). OJUKA等[20]發(fā)現(xiàn):AMPK激活劑AICAR可使L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4蛋白、MEF2A和MEF2D濃度顯著上升,而AMPK的抑制劑可以阻止這種上升. 采用0.5 mmol/L AICAR體外孵育骨骼肌18h,GLUT4蛋白升高了50%. 李良剛等[21]用AICAR孵育骨骼肌細(xì)胞,胞內(nèi)HDACs減少了29%,而GLUT4 mRNA上升了124%. 事實(shí)上,包括HDL、ApoA、脂聯(lián)素、蘆薈萃取物、二甲雙胍、蜂膠提取物和橘皮素等都可通過(guò)激活A(yù)MPK途徑促進(jìn)肌細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位[22-28]. 但AMPK途徑增加GLUT4活性并非都涉及對(duì)其基因表達(dá)的影響,也與AMPK介導(dǎo)減少肌細(xì)胞膜膽固醇、引發(fā)細(xì)胞骨架重塑有關(guān)[22,29-30]. 也有研究表明:AMPK-α2基因敲出鼠訓(xùn)練28天,其骨骼肌GLUT4基因表達(dá)和蛋白含量仍然出現(xiàn)了155%和120%的增加,說(shuō)明訓(xùn)練引起的骨骼肌細(xì)胞GLUT4增加,雖與AMPK-α2增加MEF2A的核結(jié)合有關(guān),但并非必須[31].

    本文研究發(fā)現(xiàn):電刺激60 min和120 min時(shí)GLUT4 mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照(表3),2個(gè)時(shí)間點(diǎn)GLUT4蛋白含量也顯著上升(P<0.01),該變化特性與各刺激時(shí)間AMPK-α1、α2基因表達(dá)的變化趨勢(shì)相似,由此可推測(cè)電刺激肌管引起胞內(nèi)能量狀況改變,激活骨骼肌特異和非特異AMPK通路,進(jìn)而上調(diào)GLUT4 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成,可能還有AMPK參與的其它過(guò)程共同作用,導(dǎo)致了C2C12肌管GLUT4含量的增加,有利于肌管從環(huán)境中攝取更多的糖,以供其收縮的能量和糖原合成的需要.

    2.4糖代謝的變化

    從表4可知:電刺激60 min時(shí),C2C12肌管HKⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量極明顯上升(P<0.01),電刺激120 min時(shí),該表達(dá)量雖高于對(duì)照,但差異沒(méi)有顯著性(P>0.05);電刺激60和120 min時(shí)C2C12肌管GS-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量則均極明顯上升(P<0.01).

    表4不同時(shí)間電刺激C2C12肌管HKⅡ、GS-1mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

    Table 4 Expression of HKⅡ and GS-1mRNA in C2C12 after electrical stimulation

    注:**表示與C組比較有極顯著性差異(P<0.01).

    哺乳動(dòng)物的己糖激酶有4種同工酶,其特點(diǎn)、分布及生理作用各不同[32-33]. HKⅡ主要分布在糖代謝敏感的骨骼肌和脂肪組織中,其活性受多種因素(如腫瘤、缺氧等)通過(guò)AMPK、PKC等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)[34-35]. 己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)能和線粒體外膜蛋白結(jié)合,更容易利用ATP從而加速糖原合成,同時(shí)還能向線粒體提供較多的ADP以加速三羧酸循環(huán)[36]. HKⅡ的催化作用更趨向于將G-6-P用于糖原再合成. G-6-P還可負(fù)反饋抑制糖原磷酸化酶(GP)和正反饋激活糖原合成酶(GS),并作為糖原合成的底物[37]. 當(dāng)肌糖原儲(chǔ)量較豐富,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度較大時(shí),肌糖原分解產(chǎn)生較多的G-6-P,足以抑制HK活性而限制了肌肉攝取和利用血糖. 相反,在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后期肌糖原被大量消耗,分解生成的G-6-P減少時(shí),對(duì)HK的抑制被減弱[16].AMPK可調(diào)節(jié)HKⅡ基因的表達(dá). WINDER等[38]的研究顯示:大鼠經(jīng)AICAR作用后其GLUT4和HK含量均上升,線粒體內(nèi)其它一些酶的活性也增加;紅白肌中HK基因表達(dá)上調(diào).

    運(yùn)動(dòng)可增加紅肌中GLUT4,HKII,COX-1, CS和 HAD 蛋白的含量.本研究中GLUT4基因表達(dá)和蛋白含量在2個(gè)刺激時(shí)間點(diǎn)均明顯增加,這支持了KOVAL等[39]提出的“GLUT4/HK”介導(dǎo)的葡萄糖進(jìn)入肌細(xì)胞是糖原合成的關(guān)鍵限速步驟的觀點(diǎn), GLUT4和HK相互配合,收縮先提高GLUT4對(duì)血糖入肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,HK在葡萄糖進(jìn)入肌漿后即對(duì)其進(jìn)行磷酸化[40],為糖原合成提供更多的原料. 而且,HK對(duì)葡萄糖的及時(shí)磷酸化還有利于降低肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的濃度,以及GLUT4對(duì)葡萄糖的繼續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)[41].REN等[42]認(rèn)為運(yùn)動(dòng)后GLUT4和HK活性的增加有利于運(yùn)動(dòng)后糖原的合成. 但電刺激時(shí)間延長(zhǎng)至120 min時(shí),肌管糖原含量、HKⅡmRNA表達(dá)卻沒(méi)有持續(xù)增加,可能與合成的糖原量與收縮消耗的糖原量不平衡有關(guān),且肌管ATP儲(chǔ)量的浄減少,不利于糖原合成的持續(xù)增加.

    糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的異構(gòu)體GS-1、2分別存在于骨骼肌和肝臟中. 研究顯示,GS-l是催化葡萄糖經(jīng)磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成糖原的關(guān)鍵酶,與胰島素抵抗有關(guān). 在糖原合成的一系列步驟中,GS的活性調(diào)節(jié)涉及G-6-P的變構(gòu)調(diào)節(jié),以及上游激酶和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化等作用[43]. 研究證實(shí)AMPK是糖原合成酶活性調(diào)節(jié)的上游激酶之一,許多在體及離體研究都發(fā)現(xiàn)AMPK可磷酸化GS的2號(hào)位點(diǎn),減弱其活性. 在小鼠肌肉中,AMPK-α2亞基可能對(duì)GS活性的調(diào)節(jié)起最重要作用,但是也有研究表明AMPK-α2敲出小鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)或是離體牽拉,GS的2號(hào)位點(diǎn)的磷酸化均能正常增加,這說(shuō)明AMPK-α1可能也對(duì)GS活性的調(diào)節(jié)起作用[44].

    本研究顯示:電刺激60和120 min組GS-1mRNA表達(dá)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01). 這符合運(yùn)動(dòng)后即刻糖原合成酶的活性和基因表達(dá)都會(huì)保持較高水平的規(guī)律. 有研究[45]發(fā)現(xiàn):糖原合成酶活性在運(yùn)動(dòng)中下降,運(yùn)動(dòng)后上升到峰值. 魏守剛等[46]研究發(fā)現(xiàn):耐力訓(xùn)練大鼠在力竭運(yùn)動(dòng)后24 h的恢復(fù)期中骨骼肌GS活性呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后即刻降低、1 h內(nèi)迅速升高、6 h后再次降低、24 h后又增高的變化;間歇性高強(qiáng)度訓(xùn)練大鼠運(yùn)動(dòng)后骨骼肌GS活性延遲性增高. 電刺激各組AMPK-α1的表達(dá)均顯著升高,結(jié)合AMPK能抑制GS活性,但同時(shí)還能通過(guò)GLUT4增加葡萄糖攝取的研究結(jié)果[47],本文推測(cè):HKⅡmRNA表達(dá)的升高加速了細(xì)胞內(nèi)G-6-P含量的升高,后者變構(gòu)激活GS,這一調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)度可能超過(guò)了AMPK對(duì)其磷酸化失活作用的調(diào)節(jié)強(qiáng)度,因而導(dǎo)致了電刺激60 min細(xì)胞內(nèi)糖原的含量沒(méi)有下降,反而略有上升的現(xiàn)象. 但隨著刺激和收縮時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),肌糖原合成和消耗失衡,因而導(dǎo)致刺激時(shí)間達(dá)120 min時(shí)肌糖原含量顯著下降的結(jié)果. 這些結(jié)果表明:運(yùn)動(dòng)中骨骼肌細(xì)胞雖然可以在一定時(shí)間內(nèi)通過(guò)增加攝取環(huán)境中葡萄糖,加速自身糖原合成來(lái)滿足其收縮的能量需要,但這種調(diào)節(jié)能力是有限的,如果不能及時(shí)終止運(yùn)動(dòng),最終將導(dǎo)致其糖原含量減少、運(yùn)動(dòng)能力降低,進(jìn)而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞.

    3 結(jié)論

    本文采用不同時(shí)間電刺激的方法研究了小鼠骨骼肌母細(xì)胞(C2C12)的AMPK、HK-II、GS-1基因表達(dá)、以及GLUT4基因及蛋白表達(dá)等糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)指標(biāo)的變化,結(jié)果表明:骨骼肌細(xì)胞的肌糖原消耗隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)而增加,為了保證骨骼肌細(xì)胞糖消耗的需要,可通過(guò)AMPK信號(hào)通路的調(diào)控,其膜對(duì)胞外糖轉(zhuǎn)運(yùn)的能力會(huì)隨收縮時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng);骨骼肌細(xì)胞內(nèi)糖原合成酶的合成則可隨肌糖原儲(chǔ)量的持續(xù)下降而增加.

    [1] 劉曉莉, 張曉輝, 蘭江.補(bǔ)充低聚糖對(duì)人體大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能力的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù), 2004, 8(3):516-517.

    [2] MAROTTA M, BRAGS R, GMEZ-FOIX A M. Design and performance of an electrical stimulator for long-term contraction of cultured muscle cells[J]. Biotechniques, 2004,36(1):68-73.

    [3] DERAVE W, EIJNDE B O, VERBESSEM P. Combined creatine and protein supplementation in conjunction with resistance training promotes muscle GLUT- 4 content and glucose tolerance in humans[J]. J Appl Physiol,2003,94(5):1910-1916.

    [4] ADAMS J, CHEN Z P. Intrasteric control of AMPK via the γ1 subunit AMP allosteric regulatory site[J]. Protein Sci,2004,13(1):155-165.

    [5] JOHN W S, SIMON A H, KEVIN A G, et al. CBS domains form energy-sensing modules whose binding of adenosine ligands is disrupted by disease mutations[J]. J Clin Invest,2004,113(2):274-284.

    [6] HARDIE D G. Minireview: The AMP-Activated Protein kinase cascade: The key sensor of cellular energy status[J]. Endocrinology, 2003,144(12):5179-5183.

    [7] 林強(qiáng). 電刺激促進(jìn)2型糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖運(yùn)載體4轉(zhuǎn)位的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究[D].復(fù)旦大學(xué)碩士論文,2008

    [8] FUJII N, HAYASHI T, HIRSHMAN M F, et al. Exercise induces isoform specific increase in 5′AMP-activated protein ki-nase activity in human skeletal muscle[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2003,273(3): 1150-1155.

    [9] CHEN Z P, MITCHELHILL K I, MICHELL B J, et al. AMPK signalingin contracting human skeletal muscle: acetyl-CoA carboxy-lase and NO synthase phosphorylation[J]. Am J Physiol, 2000,279(5):1202-1206.

    [10] WOJTASZEWSKI J F, JORGENSEN S B, HELLSTEN Y, et al. Glycogen-dependent effects of 5-aminoimidazole- 4-carboxamide(AICA)-riboside on AMP-activated protein kinase andglycogen synthase activities in rat skeletal muscle[J]. Diabetes, 2002, 51(2): 284-292.

    [11] DERAVE W, AI H, IHLEMANN J, et al. Dissociation of AMP-activated protein kinase activation and glucose transport incontracting slow-twitch muscle[J]. Diabetes, 2000,49(8):1281-1287.

    [12] SEAN L, MCGEE, KIRSTEN H, REBECCA L S, et al. Exercise increases nuclear AMPK α2 in human skeletal muscle[J]. Diabetes,2003,52(4):926-928.

    [13] HAYASHI T, HIRSHMAN M F, KURTH E J, et al. Evidence for 5′AMP-activared protein kinase mediation of the effect of muscle contraction on glucose transport[J]. Diabetes,1998,47(8):1369-1373.

    [14] HARDIE D G, HAWLEYET S A. AMP-activated protein kinase-development of the energy sensor concept[J]. J Physiol,2006,574(1):7-15.

    [15] TOYODA T, TANAKA S, EBIHARA K, et al. Low-intensity contraction activates the alphal-isoform of 5′-AMP-activated protein kinase in rat skeletal muscle[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 290(3): 583-590.

    [16] 許豪文.運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)概論[M]. 北京:高等教育出版社.2001.

    [17] FRITAH A, STEEL J H, PARKER N, et al. Absence of RIP140 reveals a pathway regulating GLUT4-dependent glucose uptake in oxidative skeletal muscle through UCP1-mediated activation of AMPK[J]. PLoS One,2012,7(2):E32520.

    [18] WEBER-CARSTENS S, SCHNEIDER J, WOLLERSHEIM T, et al. Critical illness myopathy and GLUT4: significance of insulin and muscle contraction[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187(4):387-396.

    [19] 李世昌,趙賢,費(fèi)朵.MEF2對(duì)肌生成的作用及運(yùn)動(dòng)對(duì)其影響的分子機(jī)制[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志, 2009,28(5):585-589.

    [20] OJUKA E O, JONES T E, NOLTE L A, et al. Regulation of GLUT4 biogenesis in muscle:evidence for involvement of ampk and ca2+[J]. Am J Phy, 2001,282(5):1008-1013.

    [21] 李良剛,陳槐卿. 減少和抑制核HDACS對(duì)骨骼肌細(xì)胞GLUT4基因表達(dá)的影響[J]. 體育科學(xué), 2007,27(12):20-26.

    [22] VI V, BUI P, EGUCHI M, et al. Adiponectin induces LKB1/AMPK-dependent glucose uptake via actin cytoskeleton remodeling[J]. J Mol Endocrinol,2013, 51(1):155-165.

    [23] DALLA-RIVA J, STENKULA K G, PETRLOVA J, et al.Discoidal HDL and apoA-I-derived peptides improve glucose uptake in skeletal muscle[J]. J Lipid Res, 2013,54(5):1275-1282.

    [24] SONG P, KIM J H, GHIM J, et al. Emodin regulates glucose utilization by activating AMP-activated protein kinase[J]. J Biol Chem,2013,288(8):5732-5742.

    [25] LEE J O, LEE S K, KIM J H, et al. Metformin regulates glucose transporter 4 (GLUT4)translocation through AMP-activated protein kinase (AMPK)-mediated Cbl/CAP signaling in 3T3-L1 preadipocyte cells[J]. J Biol Chem, 2012, 287(53):44121-44129.

    [26] SHEN J Z, MA L N, HAN Y,et al. Pentamethylquercetin generates beneficial effects in monosodium glutamate-induced obese mice and C2C12 myotubes by activating AMP activated protein kinase[J]. Diabetologia,2012,55(6):1836-1846.

    [27] UEDA M, HAYASHIBARA K, ASHIDA H. Propolis extract promotes translocation of glucose transporter 4 and glucose uptake through both PI3K and AMPK dependent pathways in skeletal muscle[J].Biofactors,2013 Jul,39(4):457-466.

    [28] KIM M S, HUR H J, KWON D Y, et al. Tangeretin stimulates glucose uptake via regulation of AMPK signaling pathways in C2C12 myotubes and improves glucose tolerance in high-fat diet-induced obese mice[J].Mol Cell Endocrinol,2012,358(1):127-134.

    [29] HABEGGER K M, HOFFMAN N J, RIDENOUR C M, et al. AMPK enhances insulin- stimulated GLUT4 regulation via lowering membrane cholesterol[J]. Endocrinology, 2012,153(5):2130-2141.

    [30] SYLOW L, JENSEN T E, KLEINERT M,et al. Rac1 is a novel regulator of contraction stimulated glucose uptake in skeletal muscle[J]. Diabetes, 2013, 62(4):1139-1151.

    [31] GONG H, XIE J, ZHANG N, et al. MEF2A binding to the GLUT4 promoter occurs via an AMPKα2-dependent mechanism[J]. Med Sci Sports Exerc, 2011, 43(8): 1441-1450.

    [32] POSTIC C, LETURQUE A, PRINTZ R L, et al. Development and regulation of glucose transporter and hexokinase expression in rat[J]. Am J Physiol,1994,266: 548-549.

    [33] ALLEN C B, GUO X L, WHITE C W. Changes in pulmonary expression of hexokinase and glucose transporter mRNAs in rats adapted to hyperoxia[J]. Am J Physiol,1998,274: 320-329.

    [34] ROBEY R B, MA J F, SANTOS A V P. Regulation of mesangial cell kexokinase activity by PKC and the MAPK pathway[J]. Am J Physiol,1999(277):742-749.

    [35] BRAITHWAITE S S, PALAZUK J R, CLOCA C W, et al. Reduced expression of hexokinase Ⅱ in insulin-resistant diabetes[J]. Diabetes, 1995(44):43-48.

    [36] 黃勇奇,吳耀生.己糖激酶-Ⅱ與腫瘤的糖代謝[J].生命的化學(xué),2004,24(4):342-344.

    [37] 黃濤,孫海生,夏志.AMPK、能量代謝與運(yùn)動(dòng)的關(guān)系研究[J].吉林體育學(xué)院學(xué)報(bào),2006,22(4):64-65.

    [38] WINDER W W, HOLMES B F, RUBINK D S, et al. Activation of AMP-activated protein kinase inereases mitoehondrial enzymes in skeletal musele[J]. J Appl Physiol,2000,88(6):2219-2226.

    [39] KOVAL J A, DEFRONZO R A, O′DOHERTY R M, et al. Regulation of HKII activity and expression in human muscle by moderate exercise[J]. Am J Physiol. Endocrinol. Metab, 1998(274): 304-308.

    [40] 韓素萍,張承玉.黃芪生藥對(duì)游泳大鼠糖代謝相關(guān)酶影響的研究[J].中國(guó)體育科技, 2008,44(2):129-132.

    [41] HOLLOSZY J O, HANSEN P A. Regulation of glucose transport into skeletal muscle.In:Reviews of Physiology[M]. Berlin:Springer-Verlag, 1996,128, 99-193.

    [42] REN J M, SEMENKOVICH E A, GULVE J, et al. Exercise induces rapid increases in GLUT4 expression,glucose transport capacity,and insulin-stimulated glycogen storage in muscle[J].J Biol Chem,1994,269:14396-14401.

    [43] YU H, HIRSHMAN M F, FUJII N, et al.Muscle-specific overexpression of wild type and R225Q mutant AMP-aetivated Protein kinase gamma-3 subunit differentially regulates glycogen accumulation[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006,291: 557-565.

    [44] HALSE R, FRYER L G D, MCCORMACK J G. et al. Regulation of glycogen synthase by glucose and glycogen:A possible role for AMP-Activated protein kinase[J]. Diabetes, 2003(52):9-15.

    [45] 全凱.不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度后糖原合成酶以及相關(guān)指標(biāo)的研究[D].北京:首都體育學(xué)院,2008.

    [46] 魏守剛, 楊則宜, 高紅. 不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方式和補(bǔ)劑對(duì)大鼠肌糖原生物合成的影響[J]. 中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2003,22(1):35-40.

    [47] 周亮. 補(bǔ)糖和刺五加促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)后糖原恢復(fù)的機(jī)理研究[D]. 北京:北京體育大學(xué), 2006.

    Keywords: skeletal muscle cells; electrical stimulation; carbohydrate metabolism; signaling pathway

    EffectsofDifferentTimeElectricalStimulationonCarbohydrateMetabolisminSkeletalMuscleCell

    XU Xiaoyang*, YAN Xujie, ZHOU Zhou, PAN Hongying, ZHAO Xiufeng

    (College of Sports Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

    The aim of this study was to measure the changes in cellular glucose intake and carbohydrate metabolism in mouse C2C12 skeletal muscle cells, and to investigate the effect on skeletal muscle cells carbohydrate metabolism by electrical stimulation of different times as well as the possible mechanism. Glycogen consumption increased continuously with prolonged contraction of skeletal muscle cells.The capacity of glucose translocation across the cell membrane was enhanced with the increase of contraction time. The activity of glycogen synthase was increased due to declining muscle glycogen reserves after 60 and 120 min electrical stimulation.And all of these changes were possibly regulated by theAMPKsignaling pathway.

    2013-08-25

    廣東省體育局2012~2013奧運(yùn)全運(yùn)專項(xiàng)攻關(guān)項(xiàng)目(201220NS046)

    *通訊作者:徐曉陽(yáng),教授,Email:xuxy@scnu.edu.cn.

    1000-5463(2013)06-0155-06

    G804.7

    A

    10.6054/j.jscnun.2013.09.021

    【中文責(zé)編:譚春林 英文責(zé)編:李海航】

    猜你喜歡
    肌管糖原骨骼肌
    糖原在雙殼貝類中的儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用研究進(jìn)展
    體育運(yùn)動(dòng)后快速補(bǔ)糖對(duì)肌糖原合成及運(yùn)動(dòng)能力的影響
    聯(lián)合收肌管神經(jīng)阻滯對(duì)膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的臨床麻醉藥理分析
    超聲波引導(dǎo)收肌管阻滯對(duì)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后鎮(zhèn)痛的臨床效果
    王建設(shè):糖原累積癥
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:08
    電刺激對(duì)胰島素抵抗的C2C12肌管糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響
    骨骼肌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的耐力運(yùn)動(dòng)應(yīng)激與適應(yīng)
    8-羥鳥嘌呤可促進(jìn)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖和分化
    TNF-α對(duì)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞生理功能的影響
    骨骼肌缺血再灌注損傷的機(jī)制及防治進(jìn)展
    水蜜桃什么品种好| 人妻一区二区av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 街头女战士在线观看网站| 精品一区二区免费观看| 偷拍熟女少妇极品色| 国产成人a∨麻豆精品| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人a区在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产精品成人在线| 我要看日韩黄色一级片| 一级黄片播放器| 99热这里只有是精品50| 国产av码专区亚洲av| 日本色播在线视频| 综合色丁香网| 亚洲av综合色区一区| 在线观看一区二区三区激情| 国产有黄有色有爽视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲人成网站在线播| 蜜桃在线观看..| 在线看a的网站| 日本wwww免费看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产91av在线免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 中文天堂在线官网| 亚洲内射少妇av| 一本久久精品| videos熟女内射| 在线精品无人区一区二区三 | 欧美3d第一页| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产免费一级a男人的天堂| 婷婷色综合大香蕉| 久久 成人 亚洲| 亚洲综合精品二区| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产精品一区三区| 永久免费av网站大全| 久热久热在线精品观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美性感艳星| 国产精品国产三级专区第一集| 久久毛片免费看一区二区三区| 午夜福利视频精品| 国产一区二区三区av在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 美女福利国产在线 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 免费观看的影片在线观看| 亚州av有码| 大陆偷拍与自拍| 日韩国内少妇激情av| 久久久欧美国产精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 91狼人影院| 永久网站在线| 久久久国产一区二区| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费黄网站久久成人精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品偷伦视频观看了| 一边亲一边摸免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| av在线老鸭窝| 1000部很黄的大片| 亚州av有码| 一级毛片我不卡| 免费黄网站久久成人精品| 国产成人freesex在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产亚洲最大av| 久久久久网色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇人妻久久综合中文| 国产在视频线精品| 成人综合一区亚洲| 久久精品人妻少妇| 欧美一区二区亚洲| 久久久久久久国产电影| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 成人无遮挡网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久99蜜桃精品久久| 国国产精品蜜臀av免费| 一级黄片播放器| 伊人久久精品亚洲午夜| 99视频精品全部免费 在线| 国产黄色免费在线视频| 日韩伦理黄色片| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美一区二区亚洲| 色视频在线一区二区三区| 91久久精品国产一区二区三区| 在线 av 中文字幕| 久久久久久人妻| 久热这里只有精品99| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美+日韩+精品| 亚洲成色77777| 老司机影院毛片| 久久久久久久久久人人人人人人| 三级经典国产精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产爱豆传媒在线观看| 黄片wwwwww| 国产亚洲最大av| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产乱来视频区| 日日啪夜夜爽| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产黄频视频在线观看| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品国产av在线观看| 一级黄片播放器| 激情 狠狠 欧美| 国产 一区精品| 麻豆成人av视频| 国产乱来视频区| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 免费看不卡的av| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本wwww免费看| 免费观看a级毛片全部| 亚洲天堂av无毛| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产一区二区三区av在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产自在天天线| 日本午夜av视频| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧洲国产日韩| 十分钟在线观看高清视频www | 91精品国产九色| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 日本av手机在线免费观看| 国产乱来视频区| 97超碰精品成人国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品欧美亚洲77777| a 毛片基地| 国产淫语在线视频| 亚洲精品自拍成人| 视频中文字幕在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| av福利片在线观看| 国产男人的电影天堂91| 一级毛片我不卡| 久久精品国产亚洲av天美| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品av视频在线免费观看| 六月丁香七月| 免费黄频网站在线观看国产| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲av福利一区| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美97在线视频| 两个人的视频大全免费| 18禁在线播放成人免费| 久久精品国产亚洲av天美| 夫妻性生交免费视频一级片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产乱人偷精品视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品午夜福利在线看| 国产淫片久久久久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看 | 亚洲国产欧美人成| 午夜精品国产一区二区电影| 在线看a的网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 偷拍熟女少妇极品色| 成年av动漫网址| 国产av码专区亚洲av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 观看美女的网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 久久青草综合色| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产在线视频一区二区| 亚洲中文av在线| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 天天躁日日操中文字幕| videossex国产| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 最后的刺客免费高清国语| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲久久久国产精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 哪个播放器可以免费观看大片| 大片电影免费在线观看免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一级黄片播放器| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色配什么色好看| 午夜免费鲁丝| 天美传媒精品一区二区| 韩国av在线不卡| 国产欧美日韩精品一区二区| 全区人妻精品视频| 成人国产麻豆网| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品一区www在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 免费av不卡在线播放| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品国产av成人精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| a级毛色黄片| 欧美日韩综合久久久久久| 高清av免费在线| 特大巨黑吊av在线直播| av网站免费在线观看视频| 日本av手机在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 夜夜骑夜夜射夜夜干| tube8黄色片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 男女国产视频网站| 中文字幕制服av| 女性生殖器流出的白浆| 99热国产这里只有精品6| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 又爽又黄a免费视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲av不卡在线观看| 黄色日韩在线| 欧美精品国产亚洲| 久久久色成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品久久久久久精品古装| 黄色一级大片看看| 日本与韩国留学比较| 搡老乐熟女国产| 水蜜桃什么品种好| 成人综合一区亚洲| 欧美xxⅹ黑人| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲美女视频黄频| 好男人视频免费观看在线| 国产乱人偷精品视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 视频区图区小说| 91在线精品国自产拍蜜月| 91精品国产九色| 看十八女毛片水多多多| 少妇人妻 视频| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产av精品麻豆| 国产男人的电影天堂91| 久久精品夜色国产| 国产免费一级a男人的天堂| 久久国产亚洲av麻豆专区| 秋霞伦理黄片| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩成人伦理影院| 全区人妻精品视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久性生活片| 免费看光身美女| 在线观看三级黄色| 超碰97精品在线观看| 大香蕉久久网| 日日撸夜夜添| 99热全是精品| 人体艺术视频欧美日本| 国产成人免费观看mmmm| 乱系列少妇在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产精品偷伦视频观看了| 国产黄片视频在线免费观看| 日日啪夜夜爽| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久青草综合色| 免费黄频网站在线观看国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 一二三四中文在线观看免费高清| 老熟女久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 伦理电影免费视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费观看av网站的网址| 国产视频首页在线观看| 亚洲av综合色区一区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av卡一久久| 精品视频人人做人人爽| 男女边摸边吃奶| av卡一久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产av码专区亚洲av| 日本vs欧美在线观看视频 | 成人特级av手机在线观看| 国产精品一区www在线观看| 久久这里有精品视频免费| av在线观看视频网站免费| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 婷婷色综合大香蕉| 亚洲成人手机| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 中国三级夫妇交换| 国产片特级美女逼逼视频| 伦精品一区二区三区| 看非洲黑人一级黄片| 国产片特级美女逼逼视频| 九九在线视频观看精品| 免费观看性生交大片5| 亚洲精品一二三| 有码 亚洲区| 日本欧美视频一区| 日韩中文字幕视频在线看片 | 大片电影免费在线观看免费| 中文字幕久久专区| 久久人人爽人人爽人人片va| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产精品久久久久久久久免| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品偷伦视频观看了| 最近的中文字幕免费完整| 交换朋友夫妻互换小说| 精品人妻熟女av久视频| 国产永久视频网站| 51国产日韩欧美| 大话2 男鬼变身卡| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 一区二区三区乱码不卡18| 五月开心婷婷网| 国产av国产精品国产| 色5月婷婷丁香| 精品一区在线观看国产| 99久久精品一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| av播播在线观看一区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 少妇精品久久久久久久| 国产熟女欧美一区二区| h日本视频在线播放| 永久免费av网站大全| 亚州av有码| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲人与动物交配视频| 五月开心婷婷网| 国产精品一及| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 涩涩av久久男人的天堂| 22中文网久久字幕| 久久99热这里只频精品6学生| av在线老鸭窝| 国产精品成人在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 人人妻人人看人人澡| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 少妇人妻久久综合中文| 最近的中文字幕免费完整| 性高湖久久久久久久久免费观看| 高清av免费在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品一区二区性色av| 一级毛片久久久久久久久女| 又爽又黄a免费视频| 国产极品天堂在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜免费观看性视频| 国产亚洲91精品色在线| a级一级毛片免费在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美高清成人免费视频www| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜视频国产福利| 国产精品爽爽va在线观看网站| av视频免费观看在线观看| 色哟哟·www| 国产av一区二区精品久久 | 婷婷色综合www| 免费观看av网站的网址| 久久久久精品性色| 国产精品国产三级专区第一集| 在线免费观看不下载黄p国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 秋霞在线观看毛片| 日本与韩国留学比较| 免费看av在线观看网站| 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚州av有码| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品女同一区二区软件| 大香蕉久久网| 午夜老司机福利剧场| 免费观看av网站的网址| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成人一二三区av| 国产一区二区在线观看日韩| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲精品色激情综合| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 一级毛片久久久久久久久女| 性高湖久久久久久久久免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 精品一区二区三区视频在线| 男人舔奶头视频| 国产69精品久久久久777片| 婷婷色综合大香蕉| 涩涩av久久男人的天堂| 九色成人免费人妻av| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久青草综合色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品国产av成人精品| 我的老师免费观看完整版| 最近的中文字幕免费完整| 国产精品成人在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品一及| av专区在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 91精品国产国语对白视频| av福利片在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线播放无遮挡| 亚洲国产欧美人成| 亚洲av成人精品一区久久| 各种免费的搞黄视频| 男人添女人高潮全过程视频| 一级二级三级毛片免费看| 不卡视频在线观看欧美| 插阴视频在线观看视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av综合色区一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 伦精品一区二区三区| 午夜福利视频精品| 亚洲电影在线观看av| 黄色视频在线播放观看不卡| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产黄色免费在线视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 欧美区成人在线视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品aⅴ在线观看| 免费在线观看成人毛片| 少妇人妻 视频| 黄色欧美视频在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 99精国产麻豆久久婷婷| 丝袜脚勾引网站| 精品人妻视频免费看| 又爽又黄a免费视频| 有码 亚洲区| 日韩国内少妇激情av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久热精品热| 纯流量卡能插随身wifi吗| 黑人高潮一二区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费观看性生交大片5| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99热6这里只有精品| 观看av在线不卡| 老女人水多毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 少妇高潮的动态图| 国产片特级美女逼逼视频| 日本av免费视频播放| 久久久久久久久久久丰满| 麻豆国产97在线/欧美| 99国产精品免费福利视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品伦人一区二区| 亚洲精品色激情综合| 亚洲无线观看免费| 最后的刺客免费高清国语| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品蜜桃在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 日本黄色日本黄色录像| 日本一二三区视频观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 中文字幕制服av| 亚洲精品色激情综合| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲精品日本国产第一区| 欧美精品一区二区免费开放| av黄色大香蕉| 我要看日韩黄色一级片| 最近中文字幕2019免费版| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男人添女人高潮全过程视频| 久久青草综合色| 国产精品一区二区性色av| 国产精品伦人一区二区| 亚洲av福利一区| 麻豆成人av视频| 国产精品久久久久成人av| 国产精品福利在线免费观看| av在线app专区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 99久久精品一区二区三区| 欧美另类一区| av在线老鸭窝| 精品午夜福利在线看| 青春草视频在线免费观看| 七月丁香在线播放| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲综合色惰| 老熟女久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一级黄片播放器| 2022亚洲国产成人精品| a级毛色黄片| 国产精品福利在线免费观看| 一级av片app| 日本午夜av视频| 中文字幕制服av| 国产成人91sexporn| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩三级伦理在线观看| 秋霞伦理黄片| 丰满迷人的少妇在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 视频中文字幕在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 日韩免费高清中文字幕av| 交换朋友夫妻互换小说| 国产视频内射| 深夜a级毛片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精品一区二区免费观看| 亚洲第一av免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 毛片女人毛片| 黄片wwwwww| 午夜视频国产福利| 能在线免费看毛片的网站| 街头女战士在线观看网站| 精品久久久噜噜| 欧美zozozo另类| 午夜日本视频在线| 丝袜喷水一区| 久久6这里有精品| 亚洲av国产av综合av卡| tube8黄色片| 国精品久久久久久国模美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩|