甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展

許正宏，吳 燕，李 會(huì)，李 恒，史勁松

(江南大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院，無(wú)錫 214122)

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，具有很強(qiáng)的抗過(guò)敏、抗感染、抗病毒等藥理活性，已被廣泛應(yīng)用于治療內(nèi)分泌失調(diào)、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、風(fēng)濕病、老年性疾病等［1－2］。甾體生物轉(zhuǎn)化即利用微生物酶對(duì)甾體底物的某一部位進(jìn)行特定的化學(xué)反應(yīng)來(lái)獲得一定的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成法相比，甾體生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、高效性和高選擇性等優(yōu)勢(shì)，還能合成化學(xué)合成法所不能合成的一些甾體中間體。近些年來(lái)，微生物轉(zhuǎn)化工藝在甾體藥物合成路線中的比例迅速增加，形成了一條生物 化學(xué)法耦聯(lián)的甾體藥物合成新工藝。最為成功的案例是利用黑根霉Rhizopus nigricans在孕甾酮的C11α引入羥基，解決了皮質(zhì)激素合成中的關(guān)鍵問(wèn)題，產(chǎn)品收率大幅度提高，專一性增強(qiáng)，效果遠(yuǎn)超化學(xué)合成法的合成效果，開(kāi)創(chuàng)了微生物轉(zhuǎn)化甾體化合物的先例［3］。

目前，甾體藥物的合成主要集中在以具有甾體母核結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物為原料、采用化學(xué)法和微生物轉(zhuǎn)化法相結(jié)合的方式來(lái)合成甾體類藥物。綜合國(guó)內(nèi)外研究，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用主要分為兩大類:①將天然原料轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)甾體化合物的普通中間體，如利用生物轉(zhuǎn)化降解植物甾醇(豆甾醇、谷甾醇、麥角固醇)邊鏈生成有用的甾體醫(yī)藥中間體，主要為雄甾-4 -烯，3，17-二酮(AD)及雄甾 -1，4 -二烯，3，17 -二酮(ADD);②對(duì)甾體藥物的特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾，生成具有生物活性但化學(xué)合成法難以合成的化合物，如 9α、11α、11β、7α、15α等位點(diǎn)的羥化，Δ1脫氫及A環(huán)的芳香化等［4］。甾體生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的多樣性，不僅解決了化學(xué)合成法步驟多、效率低、成本高和污染大的缺點(diǎn)，而且為甾體藥物的合成提供了更多的途徑。因此，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)作為甾體藥物合成工藝中的補(bǔ)充替代途徑，將成為甾體醫(yī)藥工業(yè)的關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)。

然而，在甾體類化合物的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，由于甾體底物溶解性差、培養(yǎng)基傳質(zhì)效率低、底物產(chǎn)物的反饋抑制和全細(xì)胞生物催化副產(chǎn)物多等原因，菌株的轉(zhuǎn)化能力和甾體的轉(zhuǎn)化效率仍然偏低，是甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的主要瓶頸。筆者精選了近些年生物轉(zhuǎn)化法在合成甾體藥物領(lǐng)域的突出成果，從半合成原料、菌種選育及改良、生物轉(zhuǎn)化新工藝及新技術(shù)等方面進(jìn)行綜述。

1 半合成原料

中國(guó)是甾體激素要素原料及其制劑的主要生產(chǎn)國(guó)，原料藥年產(chǎn)值近100億元，其中70%出口，且皮質(zhì)激素類原料的生產(chǎn)規(guī)模已居世界之首。但我國(guó)并非甾體激素藥物產(chǎn)業(yè)的強(qiáng)國(guó)，目前主要依賴于單一植源性薯蕷皂素、劍麻皂素及西南山地高原野生的蕃麻皂素為半合成原料，生產(chǎn)以皮質(zhì)激素為代表的低檔次初級(jí)產(chǎn)品。國(guó)際市場(chǎng)一方面大量吸收我國(guó)的低端產(chǎn)品，如氫化可的松、潑尼松等;一方面又利用其技術(shù)優(yōu)勢(shì)將其高端產(chǎn)品傾銷給我國(guó)。薯蕷皂素的日漸枯竭造成原料成本價(jià)格上升，同時(shí)合成的低端產(chǎn)品又缺乏國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，這給我國(guó)甾體藥物產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的危機(jī)。因此，需要積極努力開(kāi)發(fā)新型甾體原料資源，研究收率高、成本低、環(huán)境污染小的綠色工藝，迎頭趕上世界先進(jìn)水平，成為甾體激素藥物產(chǎn)業(yè)的強(qiáng)國(guó)。

植物甾醇，包括β -谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，主要來(lái)自于豆類植物或煉油下腳料，具有甾體化合物的母核結(jié)構(gòu)，將其“變廢為寶”能有效解決水解黃姜所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題。其中，β-谷甾醇、油菜甾醇或其19-羥化的衍生物是目前比較常用的植物甾醇，經(jīng) Mycobacterium sp.、Rhodococcus sp.和Fusarium sp.等菌屬切除邊鏈后可一步生成 AD、ADD或9α-OH -AD這3類甾體藥物中間體［5-7］。AD和ADD是最具有市場(chǎng)價(jià)值的甾體藥物中間體，對(duì)其活性部位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可用于合成多種皮質(zhì)類固醇，如鹽皮質(zhì)甾醇、口服避孕藥等其他甾體藥物。2011年，全球AD/ADD的年銷售總額高達(dá)10億美元，而且呈逐年遞增的趨勢(shì)。植物甾醇是天然無(wú)毒的活性物質(zhì)，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，其側(cè)鏈用化學(xué)手段難以降解，長(zhǎng)期以來(lái)被當(dāng)做廢物處理，微生物選擇性降解邊鏈技術(shù)使得植物甾醇被有效利用，成為薯蕷皂素的替補(bǔ)資源。

膽固醇是近些年另外一種比較受關(guān)注的甾體藥物新資源，主要是從豬、牛、魚等動(dòng)物的脂肪和油中提取所得。關(guān)于微生物降解甾醇邊鏈合成重要的甾體激素藥物已總結(jié)于圖1中。膽固醇的邊鏈降解與植物甾醇類似，在C17位斷裂氧化形成17 -甾酮［8］。該化合物是合成性激素、糖皮質(zhì)激素、利尿劑等的關(guān)鍵中間體，年生產(chǎn)量超過(guò)1000 t，其中60%都是由生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)。在所有的天然甾醇中，β-谷甾醇和膽固醇是最適合生產(chǎn)17-甾酮產(chǎn)品的，但膽固醇比β-谷甾醇的生物利用程度低，因此由膽固醇生產(chǎn)17 -甾酮的成本較高。

其他甾醇原料，如存在于酵母及真菌中的麥角甾醇，又稱麥角固醇，是一種重要的醫(yī)藥化工原料，可用于氫化可的松、黃體酮等藥物的生產(chǎn)［9］。羊毛固醇及其衍生物經(jīng)分枝桿菌 Mycobacterium sp.NRRL B -3805降解邊鏈、脫氫作用后均能形成甾體藥物的前體化合物。甾體藥物原料雖然來(lái)源廣泛，但是基本上都在C17位上有一個(gè)側(cè)鏈，需要復(fù)雜的邊鏈降解反應(yīng)才能形成藥物中間體，因此尋找新型、有效的甾體藥物前體原料仍是未來(lái)甾體生物轉(zhuǎn)化方向的熱點(diǎn)之一。

2 轉(zhuǎn)化菌種選育及改良

生物催化劑的種類不夠多、適用的反應(yīng)類型有限是當(dāng)前限制甾體生物催化發(fā)展的因素之一，因此需要大規(guī)模從自然界篩選特定功能的催化劑，或?qū)υ械拇呋瘎┻M(jìn)行改造。目前在高產(chǎn)菌株的選育中，誘變育種仍然是普遍應(yīng)用并十分有效的方法，但由于甾體類微生物的轉(zhuǎn)化菌株大多數(shù)為放線菌、霉菌等，相對(duì)細(xì)菌來(lái)講，這類菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和特殊性導(dǎo)致采用菌絲體的誘變方法很難達(dá)到預(yù)定的誘變效果。因此，在了解菌株細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)上，采用單孢子或原生質(zhì)體誘變并結(jié)合特定的篩選方法和適當(dāng)?shù)膲毫l件進(jìn)行多輪多次突變選擇效果較好。此外，隨著基因工程技術(shù)的日益完備，采用分子生物學(xué)手段對(duì)菌種的分子改造也成為比較有效且常用的方法之一。

圖1 甾醇邊鏈的降解Fig.1 Microbial degradation of sterol side-chains

2.1 原生質(zhì)體抗藥性篩選方法

由于化學(xué)或物理誘變方法所產(chǎn)生的突變是隨機(jī)的，突變無(wú)方向性，導(dǎo)致目標(biāo)菌株篩選工作量大，直接影響了誘變育種的工作效率。細(xì)胞色素P450為甾體的微生物羥化反應(yīng)中起催化作用的酶。而酮康唑等唑類化合物可以通過(guò)未共享電子對(duì)與P450的血紅素鐵形成p π -dπ作用鍵，或?qū)450保守的半胱氨酸上的巰基(SH)電子密度推向血紅素鐵，成為血紅素優(yōu)良的配體，從而與P450競(jìng)爭(zhēng)分子氧或底物，抑制P450活性［10］。因此，可以利用真菌對(duì)唑類藥物產(chǎn)生的抗藥性機(jī)制，對(duì)真菌類菌株進(jìn)行抗藥性篩選。天津科技大學(xué)王敏課題組應(yīng)用酮康挫抗性篩選法，采用紫外線誘變處理的甾體11β -羥基化菌株——新月彎孢霉的原生質(zhì)體(有完整核型)，獲得了氫化可的松轉(zhuǎn)化率為出發(fā)菌株1.42倍的遺傳穩(wěn)定突變株［11］。借助絲狀真菌的原生質(zhì)體，結(jié)合傳統(tǒng)的理化誘變/抗性篩選，再生具有完成核型的細(xì)胞克隆，分離選育具有甾體11β -羥基化能力的穩(wěn)定型菌株可行且有效，該菌種選育方法可對(duì)選育其他細(xì)胞色素P450催化的羥基化菌株提供借鑒。

2.2 多代壓力組合突變法

Donova等［12］報(bào)道了由谷甾醇產(chǎn)生9α-OHAD分枝桿菌突變菌株篩選的研究。應(yīng)用谷甾醇的選擇壓力，結(jié)合傳統(tǒng)誘變作用，獲得能夠轉(zhuǎn)化谷甾醇為9α-OH -AD的菌株，而野生分枝桿菌只能將谷甾醇轉(zhuǎn)化為AD。采用多代壓力組合突變法的具體流程:①菌種的馴化誘變，在選擇性底物谷甾醇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)10次，獲取得到能輕微產(chǎn)生9α-OH -AD的菌株，采用紫外(UV)輻射方法篩選突變菌株，得到既能夠切除谷甾醇邊鏈、又能向9α位引入羥基的菌株。繼而與底物谷甾醇保溫培養(yǎng)。經(jīng)多批馴化，轉(zhuǎn)化效率由首批的2.7%提高到59.6%的產(chǎn)物積累濃度;②繼續(xù)采用谷甾醇選擇壓力，并結(jié)合傳統(tǒng)的化學(xué)誘變劑-甲基磺酸乙酯(EMS)和絲裂霉素C進(jìn)行UV輻照處理。經(jīng)由多代的谷甾醇?jí)毫M合突變選擇，是獲得9α-OH -AD菌株的一種有效方法。

2.3 菌株的分子改造

針對(duì)在甾體生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生產(chǎn)物進(jìn)一步降解及其他副產(chǎn)物的問(wèn)題，可采用將引起副產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因敲除的方法。例如Brzostek等［13］在研究Mycobacterium降解植物甾醇時(shí)，敲除羥化酶基因后能部分抑制母核的降解，這可能是因?yàn)?α -羥化酶具有同工酶，或者編碼9α -羥化酶的是一個(gè)基因簇，9α羥化是酶共同作用的結(jié)果。

為了提高甾體羥基化反應(yīng)的效率，研究者們將甾體P450酶在工程菌種中進(jìn)行異源表達(dá)。例如，將能夠催化甾體17α -羥化和C17，20 -裂解酶反應(yīng)的全功能人的P45017α(CYP17)在畢赤酵母GS115中表達(dá)，表達(dá)的酶能夠催化黃體酮生成17α -羥基孕酮和16 -羥基孕酮［14］。羥化反應(yīng)的效率也可以通過(guò)輔酶與P450氧化酶共表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。Pertric等［15］將來(lái)源于米根霉Rhizopus oryzae的11α -羥化酶(CYP509C12)與依賴于NAD(P)H的P450還原酶在分泌型表達(dá)的酵母宿主中共表達(dá)，與僅表達(dá)11α -羥化酶(CYP509C12)相比，11α羥化反應(yīng)的速率提高了7倍。

另外，將合成生物學(xué)的概念應(yīng)用于甾體生物轉(zhuǎn)化，將合成甾體化合物的整個(gè)代謝途徑打通，實(shí)現(xiàn)單一微生物的多步轉(zhuǎn)化。一個(gè)最為典型的例子是將13個(gè)不同來(lái)源的基因在釀酒酵母中異源表達(dá)，通過(guò)對(duì)兩條線粒體系統(tǒng)的調(diào)控和3個(gè)編碼的非目的反應(yīng)基因的敲除，使得原本僅產(chǎn)生麥角甾醇的酵母菌能在利用糖和醇的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生氫化可的松［16］。該工作證明了由高級(jí)真核微生物的復(fù)雜代謝途徑轉(zhuǎn)移到低等微生物中的可行性。但重組菌種以20 g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化時(shí)，最高獲得氫化可的松的質(zhì)量濃度僅為(11.5±0.3)mg/L，轉(zhuǎn)化效率較低。

3 甾體生物轉(zhuǎn)化新工藝與新技術(shù)

近些年來(lái)，雖然在選育甾體有效生物催化劑上取得了一定成效，但甾體的低水溶性(10－6～10－5mol/L)仍是生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的主要限制因素。由于甾體疏水性強(qiáng)，甾體轉(zhuǎn)化酶為胞內(nèi)酶，導(dǎo)致底物與全細(xì)胞催化劑接觸不充分，造成底物的利用率不高，轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)。因此，提高底物在轉(zhuǎn)化體系中的有效反應(yīng)濃度、加速底物與產(chǎn)物進(jìn)出胞內(nèi)外的過(guò)程是開(kāi)發(fā)新型轉(zhuǎn)化工藝以提高甾體轉(zhuǎn)化率的核心。目前，針對(duì)上述問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于三大方向:提高底物溶解性、建立新型轉(zhuǎn)化體系、改善細(xì)胞通透性。

3.1 物理、化學(xué)助溶法

甾體化合物是脂溶性化合物，在水中溶解度低，故反應(yīng)過(guò)程中以液態(tài)形式存在的底物有效濃度偏低，使得反應(yīng)過(guò)程不能有效進(jìn)行。因此，采用合適的手段改善底物在反應(yīng)過(guò)程中的有效濃度，能提高底物的轉(zhuǎn)化率和縮短轉(zhuǎn)化周期。

3.1.1 底物微粉化

通過(guò)物理(如超聲波)或機(jī)械(如研磨)的方法處理底物使其成為納米或微米級(jí)的微粒，提高底物在水中的分散度和溶解速率，從而增加底物分子與酶的接觸機(jī)會(huì)，反應(yīng)持續(xù)向產(chǎn)物方向移動(dòng)。比較成功的例子是工業(yè)上用氣流粉碎的方法粉碎醋酸可的松，加入少量乙醇助溶后直接投料，在底物投料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的條件下可將底物轉(zhuǎn)化率提高到90%。

有機(jī)溶劑或表面活性劑預(yù)溶底物，即先將底物用乙醇、丙酮、N，N -二甲基甲酰胺等有機(jī)試劑或表面活性劑Tween -80、Tween -20預(yù)溶，然后再以液體的形式加入到發(fā)酵液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這是目前比較常用的提高底物溶解度的方法。徐詩(shī)偉等［17］研究地塞美松(dexamethasone)中間體的C1，4 -脫氫和11α -羥基化時(shí)，采用體積分?jǐn)?shù)為2% ～4%的N，N -二甲基甲酰胺預(yù)溶解底物后進(jìn)行投料，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高約40%。添加有機(jī)溶劑在某些轉(zhuǎn)化反應(yīng)中還能抑制副產(chǎn)物生成，Angelova等［18］在研究有機(jī)溶劑對(duì)紅球菌(Rhodococcus sp.)羥化AD的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體系中添加鄰苯二甲酸酯可以顯著抑制AD母核C1，2位的脫氫反應(yīng)，同時(shí)將9α -羥化產(chǎn)物的產(chǎn)量提高到60%。有機(jī)試劑能在一定程度上改變底物的溶解度，但對(duì)菌體有一定的毒害作用，在特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)過(guò)程中，要根據(jù)底物特性和菌體的有機(jī)溶劑耐受性，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索選擇合適的有機(jī)試劑和相應(yīng)的濃度。

3.1.2 環(huán)糊精包合法

環(huán)糊精及其衍生物(如甲基-β -環(huán)糊精，羥丙基-β -環(huán)糊精)能形成疏水性空腔，通過(guò)氫鍵、分子間作用力、范德華力等可以與甾體類疏水性強(qiáng)的客體分子相互作用而形成包合物。Lu等［19］將環(huán)糊精用于Arthrobacter simplex TCCC 11037轉(zhuǎn)化醋酸可的松(CA)為醋酸強(qiáng)的松(PA)的脫氫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)添加環(huán)糊精可將底物、產(chǎn)物的溶解度分別提高36.7倍和19.8倍，同時(shí)解決了底物溶解度差和產(chǎn)物的反饋抑制問(wèn)題，從而提高甾體化合物的利用效率。Donova等［20］研究了甲基-β -環(huán)糊精(M-β -CD)對(duì)AD/ADD的產(chǎn)量、細(xì)胞的生長(zhǎng)以及細(xì)胞膜組成和超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中添加M-β -CD后能使AD/ADD的產(chǎn)量提高1.6倍。因此，根據(jù)甾體化合物的結(jié)構(gòu)特性，合成新型的環(huán)糊精衍生物，同時(shí)全面分析甾體底物與環(huán)糊精的分子識(shí)別機(jī)制，將有利于進(jìn)一步挖掘環(huán)糊精在微生物轉(zhuǎn)化甾體領(lǐng)域的潛能。

單一使用某種有機(jī)試劑、表面活性劑或環(huán)糊精的效果有限，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以根據(jù)各自的優(yōu)缺點(diǎn)設(shè)計(jì)“復(fù)合配方”，在不影響菌體生長(zhǎng)的前體下，到達(dá)高底物投料濃度、高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)物得率的目的。

3.2 建立新型轉(zhuǎn)化體系

生物轉(zhuǎn)化過(guò)程可以分為底物分子向胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)、酶促反應(yīng)和產(chǎn)物分子向胞外分泌3個(gè)過(guò)程。其中，酶促反應(yīng)速率主要是由生物酶固有的活性所決定，而底物和產(chǎn)物分子的傳遞速率是可以通過(guò)外界條件來(lái)控制的。目前，大部分的研究主要致力于尋找新型轉(zhuǎn)化體系，以提高甾體的轉(zhuǎn)化效率，筆者列舉了近年來(lái)一些新型的轉(zhuǎn)化體系，并比較各種轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)歸納于表1。

表1 不同甾體微生物轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and drawbacks of various biotransformation systems

雙液相轉(zhuǎn)化體系和雙水相轉(zhuǎn)化體系根據(jù)底物和產(chǎn)物在兩相中分配系數(shù)的不同，能較好解決底物、產(chǎn)物水溶性差的問(wèn)題，而且能隨底物的特性改變兩相的組分，體系易制備且靈活性較大，故是目前工業(yè)上應(yīng)用得比較多的轉(zhuǎn)化工藝。為解除有機(jī)試劑對(duì)細(xì)胞呼吸鏈的損害，保證細(xì)胞的活性，可以將固定化技術(shù)與兩相催化技術(shù)耦合，通過(guò)固定化對(duì)生物酶形成保護(hù)層，互補(bǔ)缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化“高速、高效”相統(tǒng)一的方法。

隨著人們對(duì)轉(zhuǎn)化體系研究的不斷深入，新興的濁點(diǎn)系統(tǒng)、離子液體開(kāi)始受到廣泛的關(guān)注。底物在濁點(diǎn)系統(tǒng)的兩相中是不均勻分配的，因此能控制底物的擴(kuò)散速率，保證轉(zhuǎn)化過(guò)程中底物始終處于最適濃度，既能解除底物的抑制效應(yīng)又能提高傳質(zhì)速率，還能原位萃取產(chǎn)物而避免產(chǎn)物的反饋抑制。Wang 等［21］建立了Triton X -100和Triton X -114形成的濁點(diǎn)系統(tǒng)，并將其應(yīng)用于Mycobacterium sp.降解膽固醇的邊鏈，AD和ADD的產(chǎn)量得到大幅度提高。

另外一種新型轉(zhuǎn)化系統(tǒng)——離子液體，是完全由離子組成的液體，在低溫(＜100℃)下呈液態(tài)的鹽，也稱為低溫熔融鹽，它一般由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)陰離子所組成。最初的離子液體主要用于電化學(xué)研究，近年來(lái)離子液體作為綠色溶劑在有機(jī)及高分子合成領(lǐng)域受到重視。Wu等［22］研究了離子液體對(duì)黑根霉(Rhizopus nigricans)11α -羥化 16α，17α-環(huán)氧黃體酮的影響，發(fā)現(xiàn)［BMIm］［PF6］-水組成的兩相體系能在底物濃度為18 g/L的條件下將底物轉(zhuǎn)化率提高到90%以上，且轉(zhuǎn)化體系連續(xù)利用3個(gè)批次后，總轉(zhuǎn)化率仍能達(dá)到87%。由于離子液體具有高效、無(wú)毒、無(wú)污染、回收方便和可重復(fù)使用等優(yōu)勢(shì)，為全細(xì)胞生物催化的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3.3 細(xì)胞通透性改良法

甾體轉(zhuǎn)化酶屬于胞內(nèi)酶，甾體分子必須跨過(guò)壁膜與酶接觸才可參加反應(yīng)，所以細(xì)胞的通透性直接影響甾體化合物的轉(zhuǎn)化。早在1982年，Jawofski等［23］在去氫可的松的 11β -羥化中添加適量的稀KOH溶液、蝸牛酶、乙二胺四乙酸(EDTA)處理真菌Anninghamella屬孢子，發(fā)現(xiàn)其外形變得膨大，膜上有微孔出現(xiàn)，羥化產(chǎn)量可以提高2～4倍。利用Mycobacterium sp.降解谷甾醇邊鏈時(shí)，在其培養(yǎng)基中加入微量青霉素、多粘菌素、桿菌肽和乙胺丁醇等抗生素，可以抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，提高細(xì)胞通透性，在一定程度上提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 AD的產(chǎn)量［24］。隨后，利用透射電鏡觀察了添加桿菌肽和不添加桿菌肽處理的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)添加桿菌肽后細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸形，推測(cè)這種畸形有利于改善細(xì)胞壁的通透性和減少底物的跨膜阻力，最終達(dá)到提高轉(zhuǎn)化效率的目的。

此外，在菌體培養(yǎng)的過(guò)程中加入卵磷脂、魚精蛋白、聚乙烯亞胺、m -氯苯丙氨酸等試劑也能在一定程度上影響細(xì)胞壁的合成或改變細(xì)胞壁組成成分，提高甾體的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物得率。添加細(xì)胞壁干預(yù)劑來(lái)提高細(xì)胞膜的通透性，在提高單位菌體量的比酶活上有一定程度的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)菌體生物量會(huì)造成一定的負(fù)影響。

制備原生質(zhì)體用于甾體轉(zhuǎn)化是另一種有效解除細(xì)胞壁阻礙作用的方法。王敏等［25］利用新月彎孢霉原生質(zhì)體對(duì)氫化可的松進(jìn)行11β -羥化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用溶壁酶(2.5 mg/mL)和纖維素酶(5 mg/mL)的混合酶液溶解藍(lán)色犁頭霉可形成大量原生質(zhì)體，且其11β-羥化酶活性明顯高于完整菌絲體，在底物濃度相等的情況下可將轉(zhuǎn)化周期由48 h縮短至36 h。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)雖然有效改善了底物的傳質(zhì)阻力，但存在穩(wěn)定性差、再生迅速等問(wèn)題，嚴(yán)重限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)顯示出化學(xué)合成技術(shù)所無(wú)法取代的優(yōu)勢(shì)，吸引了大批國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)甾體生物轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)。雖然在菌種的選育及改良、提高底物溶解性、建立新型轉(zhuǎn)化體系等方面取得了顯著的成果，但是大多數(shù)菌株的生產(chǎn)力仍未達(dá)到工業(yè)化水平，造成基礎(chǔ)研究與產(chǎn)業(yè)化相脫節(jié)。甾體生物轉(zhuǎn)化的研究依然任重道遠(yuǎn)，需要新思路、新思維、新方法進(jìn)行更深入、更全面的研究，最終達(dá)到降低生產(chǎn)成本、提高轉(zhuǎn)化效率、減少有毒有害試劑使用的目的。

生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在甾體藥物合成領(lǐng)域的趨勢(shì)主要集中在以下幾個(gè)方面:①菌株方面，利用高通量篩選技術(shù)尋找新型高效優(yōu)良的轉(zhuǎn)化菌株，其中海洋微生物具有很大的潛力;利用組合誘變技術(shù)對(duì)已有菌株進(jìn)行改良，提高底物轉(zhuǎn)化率和底物廣譜性。②尋找新型甾體藥物原材料，如從種類繁多的海洋生物中獲得多種多樣結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新甾體化合物;采用不同菌株對(duì)多種甾體化合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以期獲得新的甾體衍生物，增加甾體藥物前體的品種，為甾體藥物的合成提供新途徑。③轉(zhuǎn)化新工藝的研究，將固定化技術(shù)、混合培養(yǎng)技術(shù)、兩相催化技術(shù)或幾種技術(shù)的耦合應(yīng)用于甾體轉(zhuǎn)化過(guò)程，以提高轉(zhuǎn)化效率和降低生產(chǎn)成本，提高甾體轉(zhuǎn)化的水平和競(jìng)爭(zhēng)力。④將基因工程成熟的技術(shù)手段應(yīng)用甾體微生物轉(zhuǎn)化，如采用基因工程技術(shù)敲除某些旁路酶基因，切斷副產(chǎn)物的形成途徑;通過(guò)分子生物學(xué)手段，獲得某個(gè)或某些關(guān)鍵酶的基因并在合適的宿主中表達(dá)，得到大量的重組蛋白后對(duì)酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，再通過(guò)理性的定點(diǎn)突變技術(shù)或非理性定向進(jìn)化技術(shù)從基因水平上改造酶的特異性、穩(wěn)定性、高效性。

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