發(fā)酵法制備富馬酸的關(guān)鍵技術(shù)及其進(jìn)展

李 霜，徐 晴，黃 和

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800)

富馬酸是一種重要的四碳平臺(tái)化合物，被美國能源部列為優(yōu)先發(fā)展的12種平臺(tái)化合物之一［1］，可作為有機(jī)化工原料和精細(xì)化工產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于材料(樹脂、涂料及增塑劑等)、醫(yī)藥、化工、食品及飼料添加劑等領(lǐng)域［2－3］。富馬酸口味純正，酸度是檸檬酸的1.5倍，不僅沒有毒副作用，而且對抑菌、防腐有顯著功效，成為近年來興起的一種新型食品調(diào)味劑。2010年衛(wèi)生部批準(zhǔn)了富馬酸一鈉作為食品添加劑使用［4］。富馬酸經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化可制備L-蘋果酸和L-天冬氨酸，前者是世界排名第三的食品酸味劑，成為目前最有發(fā)展前景的有機(jī)酸之一［5］;后者可用于各種食品飲料添加劑、有機(jī)合成中間體及生化試劑等。

當(dāng)前富馬酸產(chǎn)業(yè)主要以苯為出發(fā)原料，采用順酐異構(gòu)化工藝路線，我國產(chǎn)能已逾10萬t規(guī)模;近年來化石資源價(jià)格攀升，食品級富馬酸價(jià)格已接近10 000元/t。隨著人們對食品、醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)品“天然、營養(yǎng)”關(guān)注度的提升，以天然可再生資源為原料，利用微生物發(fā)酵法制備富馬酸，不僅有助于實(shí)現(xiàn)資源替代，更為富馬酸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和提升提供了技術(shù)支撐。

根霉屬被認(rèn)為是最佳的富馬酸生產(chǎn)菌。利用根霉菌發(fā)酵法制備富馬酸的研究已逾半個(gè)世紀(jì)，主要有以下幾個(gè)技術(shù)難點(diǎn)阻礙了產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程:①根霉菌缺乏遺傳操作工具，菌株定向改造難度大;②根霉菌形態(tài)發(fā)育機(jī)制不明，發(fā)酵過程控制難;③富馬酸及其主要衍生物L(fēng) -蘋果酸、L -天冬氨酸的生產(chǎn)缺乏系統(tǒng)集成、工藝繁瑣、成本高。筆者針對生物法制備富馬酸的技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，從優(yōu)良菌株的選育和發(fā)酵過程控制等角度對制約生物基富馬酸的關(guān)鍵工程技術(shù)進(jìn)行闡述。

1 根霉菌發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸代謝機(jī)制

1985年，Osmani等［6］提出了根霉菌產(chǎn)富馬酸的“胞液途徑”學(xué)說，成為目前的主流觀點(diǎn)。他們認(rèn)為少根根霉的胞液中存在一條完整的“TCA還原途徑”，丙酮酸羧化酶是該途徑關(guān)鍵酶之一，它催化固定化CO2與丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶的作用下生成蘋果酸，蘋果酸再在富馬酸酶的作用下生成富馬酸(圖1)。該途徑是富馬酸的主要途徑，其中丙酮酸羧化酶的作用更為重要，它起著固定CO2的作用，這也是實(shí)際生產(chǎn)中富馬酸對葡萄糖的摩爾轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)高于100%的根本原因;而線粒體內(nèi)TCA循環(huán)途徑的主要作用是提供能量(ATP)、還原力(NADH)和中間代謝產(chǎn)物以供菌體生長。

Kenealy等［7-8］通過生理生化研究，從不同方面證實(shí)了Osmani等的觀點(diǎn)，即胞液中的TCA還原途徑才是根霉菌積累富馬酸的主要途徑。1996年，Wright等［9］通過14C同位素標(biāo)記的方法構(gòu)建了 R.oryzae的葡萄糖代謝模型，證明了胞內(nèi)存在2個(gè)獨(dú)立控制的丙酮酸代謝池，一個(gè)存在于胞液中，用于合成乙醇、乳酸、草酰乙酸、蘋果酸及富馬酸等，另一個(gè)主要用于TCA循環(huán)(圖1)。高產(chǎn)富馬酸的根霉菌除了能生產(chǎn)富馬酸外，還能產(chǎn)生其他低濃度的羧酸，如蘋果酸、乳酸和檸檬酸等，某些條件下還可能會(huì)積累乙醇。乙醇、乳酸與富馬酸的合成途徑，甚至包括TCA循環(huán)，它們之間在丙酮酸的分配利用上是一種競爭關(guān)系(圖1)。同時(shí)TCA循環(huán)又為乙醇、乳酸及富馬酸的合成提供能量及還原力，因此它們之間又是一種共存關(guān)系。這是一種矛盾共存體，需要在2個(gè)丙酮酸代謝池之間尋求一種碳流分配的平衡，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物積累的最優(yōu)化。

圖1 米根霉積累富馬酸及其副產(chǎn)物的主要代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of fumaric acid and byproducts in Rhizopus oryzae

富馬酸的胞液合成途徑成為近年來的重要生理研究方向。Song等［10］采用RT-PCR擴(kuò)增得到了富馬酸酶基因(fumR)，酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果表明該酶為富馬酸積累時(shí)期的胞液富馬酸酶，主要催化L-蘋果酸向富馬酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。此后，Ding等［11］進(jìn)一步研究了碳氮比對胞液富馬酸酶活力及富馬酸積累的影響，結(jié)果表明N源限制對該酶活力影響顯著，且與富馬酸積累成正相關(guān)。上述研究表明胞液途徑是富馬酸積累的主要途徑，該途徑的強(qiáng)弱與限氮營養(yǎng)條件有關(guān)。鑒于富馬酸酶在胞液途徑中的重要作用，Zhang等［12］將fumR基因在米根霉進(jìn)行了過表達(dá)研究，結(jié)果表明單一強(qiáng)化富馬酸酶活性并不能提高富馬酸產(chǎn)量，由于富馬酸酶同時(shí)能將富馬酸轉(zhuǎn)化為L -蘋果酸，導(dǎo)致L-蘋果酸產(chǎn)量有所提高。

2 富馬酸生產(chǎn)菌種的選育及構(gòu)建

2.1 高效積累富馬酸的根霉菌選育

由于根霉菌缺乏定向基因操作的工具元件，因此采用誘變育種方法提高富馬酸產(chǎn)量成為高產(chǎn)菌株的主要選育手段。徐文雯等［13－14］均對高效篩選方法做了有益探索，設(shè)計(jì)了溴甲酚綠加塑料小管的平板菌種初篩策略，建立了適合于產(chǎn)酸絲狀真菌誘變選育的變色圈平板初篩法，大大降低了誘變育種后高產(chǎn)菌株選育的工作量。徐文雯等［13］以少根根霉為出發(fā)菌株，通過UV和LiCl誘變，獲得了搖瓶發(fā)酵富馬酸產(chǎn)量達(dá)55 g/L的高產(chǎn)菌株;臧茹［14］以米根霉為出發(fā)菌株，采用UV反復(fù)誘變方式，獲得的高產(chǎn)菌株在5 L罐發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)41 g/L。米根霉在積累富馬酸時(shí)，主要代謝副產(chǎn)物為乙醇;因此，削弱乙醇代謝途徑成為一種改造策略。Fu等［15］以丙烯醇為篩選壓力，篩選了乙醇途徑中關(guān)鍵酶醇脫氫酶(ADH)活力降低的菌株，乙醇積累量降低83.7%，富馬酸產(chǎn)量增加21%，搖瓶發(fā)酵達(dá)52.7 g/L。

2.2 利用基因工程手段構(gòu)建富馬酸生產(chǎn)菌

以丁二酸為代表的利用基因工程手段構(gòu)建有機(jī)酸生產(chǎn)菌株已經(jīng)獲得了長足的發(fā)展，目前重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵水平已逾100 g/L［16］。相比而言，利用基因工程手段構(gòu)建的富馬酸生產(chǎn)菌株仍處于很低的積累水平。

Kaclíková 等［17］構(gòu)建了缺失線粒體富馬酸酶釀酒酵母工程菌用來積累富馬酸，以葡萄糖為底物時(shí)，最高富馬酸積累量不到0.5 g/L。此前的代謝途徑研究中，由于丙酮酸羧化酶對于富馬酸積累具有重要影響，因此，吳世根等［18］構(gòu)建了過表達(dá)丙酮酸羧化酶的Pichia pastoris，結(jié)果表明富馬酸合成途徑的碳流分配得到提升，草酰乙酸和L -蘋果酸的積累都得到了顯著增加，而富馬酸的積累僅從38.71 mg/L增加到40.05 mg/L。Xu等［19］以釀酒酵母為表達(dá)宿主，通過過表達(dá)來自米根霉的富馬酸酶基因和蘋果酸脫氫酶基因以及釀酒酵母自身的丙酮酸羧化酶基因，重構(gòu)了富馬酸合成途徑，富馬酸的積累量僅為3.18 g/L。據(jù)推測，導(dǎo)致重組菌富馬酸產(chǎn)量低的一個(gè)重要原因可能在于宿主細(xì)胞如E.coli或酵母中缺乏富馬酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，導(dǎo)致富馬酸難以被分泌至胞外。上述研究表明，采用基因工程手段構(gòu)建的產(chǎn)富馬酸重組菌株，在技術(shù)經(jīng)濟(jì)性上還難以與根霉菌競爭。

3 利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵制備富馬酸

現(xiàn)有檸檬酸、乳酸等大宗有機(jī)酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)均以淀粉基原料如玉米粉、木薯粉、淀粉等來進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。以玉米淀粉為例，相比葡萄糖的價(jià)格，每噸原料的成本便宜800～1 000元，有助于進(jìn)一步降低原料成本。在已報(bào)道的富馬酸發(fā)酵工藝中，仍以葡萄糖為主要原料，表明相關(guān)研究離富馬酸的產(chǎn)業(yè)化尚有距離［20］。淀粉基原料相比糖蜜、果汁等原料，來源廣泛且價(jià)格相對平穩(wěn)，更具備工業(yè)可操作性。

3.1 原料的選擇

在根霉菌發(fā)酵積累富馬酸的發(fā)酵工藝研究中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比成為研究根霉菌生產(chǎn)富馬酸過程的考察重點(diǎn)，高碳氮比是實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率的前提。Zhou等［21－22］在利用根霉菌生產(chǎn)富馬酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加N源，也獲得了不錯(cuò)的發(fā)酵結(jié)果。Moresi等［23－24］在 R.arrhizus發(fā)酵產(chǎn)富馬酸過程中嘗試使用包括馬鈴薯淀粉、玉米淀粉及木薯淀粉在內(nèi)的不同來源的淀粉水解液，并對淀粉水解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，利用土豆淀粉的產(chǎn)酸速率可達(dá)0.35 g/(L·h)。除純淀粉原料外，其余粗淀粉基原料如全玉米粉、脫胚玉米粉、木薯粉等均因?yàn)楹幸欢ǖ牡M分，對產(chǎn)酸發(fā)酵過程具有顯著影響。丁月月［25］考察了淀粉、全玉米粉、脫胚玉米粉和木薯粉4大類淀粉原料的含氮量及其對富馬酸發(fā)酵的影響，結(jié)果表明淀粉是最適原料，而其余粗原料中，脫胚玉米粉由于含氮量相對較低，成為最適粗原料。

3.2 工藝優(yōu)化

以淀粉基為原料時(shí)，涉及原料預(yù)處理工藝，如淀粉原料的糊化、液化以及糖化等工藝，將預(yù)處理工藝與發(fā)酵結(jié)合起來，又可分為分步水解發(fā)酵(SHF)和同步糖化發(fā)酵(SSF)等工藝。其中，同步糖化發(fā)酵工藝不僅省去了淀粉質(zhì)原料酸解或酶解的過程，節(jié)約設(shè)備投資，降低了過程成本，而且糖化產(chǎn)生的底物可直接為菌體利用，減少單糖或雙糖的積累，減輕糖化過程的抑制作用，增加水解速率，有利于維持較高的生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短發(fā)酵周期。因此，同步糖化發(fā)酵是高底物濃度在小反應(yīng)體積下進(jìn)行低成本生產(chǎn)的最佳方式。

在乳酸發(fā)酵研究中，對粗淀粉基原料的各種水解工藝與發(fā)酵工藝開展了較為全面的研究，為乳酸的高效制備奠定了基礎(chǔ)［26］。成熟的檸檬酸發(fā)酵工業(yè)中，一直利用黑曲霉自產(chǎn)的糖化酶進(jìn)行同步糖化發(fā)酵工藝。富馬酸生產(chǎn)菌株米根霉，具有一定的糖化酶活力，但完全利用自身的糖化酶尚不足以完成同步糖化發(fā)酵過程。筆者所在課題組對利用淀粉基原料制備富馬酸開展了系列研究［25，27］，對同步糖化發(fā)酵制備富馬酸的過程進(jìn)行了優(yōu)化，通過添加少量糖化酶(終用量3.4 U/L)即可實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵過程;以脫胚玉米粉為C源時(shí)，富馬酸產(chǎn)量達(dá)35.5 g/L。通過誘變育種方式獲得糖化酶活力提高的米根霉菌株，突變株糖化酶體積活力由7.2 U/mL提高至18.6 U/mL，利用自產(chǎn)糖化酶以淀粉為原料同步糖化發(fā)酵時(shí)，富馬酸產(chǎn)量達(dá)44 g/L［28］。同步糖化工藝制備富馬酸的相關(guān)研究，為利用檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的裝置生產(chǎn)富馬酸提供了技術(shù)支撐，有助于產(chǎn)業(yè)推廣。

4 利用纖維質(zhì)原料發(fā)酵制備富馬酸

木質(zhì)纖維素資源極為豐富，以木質(zhì)纖維素資源作為生物發(fā)酵原料時(shí)，需要通過預(yù)處理技術(shù)如酸水解、堿水解和酶解等手段將原料水解產(chǎn)生木糖、葡萄糖等可發(fā)酵性糖，再經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物。木質(zhì)纖維素中的木糖占總質(zhì)量組分的25%～40%，其生物可利用度較差，阻礙了木質(zhì)纖維素的高效利用，影響了經(jīng)濟(jì)性。

目前，利用木質(zhì)纖維素產(chǎn)化學(xué)品的研究主要集中在乙醇，但乙醇對糖的轉(zhuǎn)化率較低，葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇的理論轉(zhuǎn)化率僅51%，而對L -乳酸的理論轉(zhuǎn)化率約100%，對富馬酸的理論轉(zhuǎn)化率達(dá)129%，故用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)有機(jī)酸理論上較乙醇具有更高的原料利用。Mass等［29］指出利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)有機(jī)酸等大宗化學(xué)品是未來的主要發(fā)展方向。

Kautola等［30］利用木糖為原料，采用固定化少根根霉發(fā)酵10.25 d后得到富馬酸最大產(chǎn)量為16.4 g/L，獲得的最高體積生產(chǎn)率僅為0.087 g/(L·h)。Woiciechowski等［31］以蒸爆法處理木料后，水解液用于米根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸，富馬酸產(chǎn)量為5.085 g/L。Liao等［32］以牛糞為原料，利用米根霉發(fā)酵富馬酸聯(lián)產(chǎn)幾丁質(zhì)，發(fā)酵4 d后富馬酸轉(zhuǎn)化率達(dá)31%，生物量為11.5 g/L，其中幾丁質(zhì)產(chǎn)率為0.21 g/g生物質(zhì)。以木質(zhì)纖維素、糞肥等生物質(zhì)資源作為發(fā)酵培養(yǎng)基的C源，雖然原料來源廉價(jià)且豐富，但富馬酸產(chǎn)量低，生產(chǎn)速率差，制約了其應(yīng)用前景。

根霉菌具有天然的木糖代謝途徑，以木糖為唯一C源時(shí)，能利用木糖進(jìn)行生長代謝。同樣，根霉菌也存在“碳代謝阻遏效應(yīng)”，木糖葡萄糖共存的條件下會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖。筆者所在課題組對根霉菌利用木糖和葡萄糖的代謝特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明:以木糖為C源時(shí)，代謝反應(yīng)趨向于合成反應(yīng)，細(xì)胞總蛋白質(zhì)、總脂肪以及總糖等組分較高，幾乎不積累有機(jī)酸;以葡萄糖為C源時(shí)，代謝反應(yīng)趨向于有機(jī)酸、乙醇的積累［33］。這一代謝特征顯示，采用分步利用木糖和葡萄糖的技術(shù)路線［34］，以木糖為根霉菌種子培養(yǎng)的C源和以葡萄糖為產(chǎn)酸發(fā)酵的C源有助于實(shí)現(xiàn)對木質(zhì)纖維素資源的全利用。Xu等［35］以玉米秸稈為原料，利用稀酸水解半纖維素組分獲得的木糖進(jìn)行根霉菌的種子培養(yǎng)，酶解纖維素組分獲得的葡萄糖進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵，葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)，富馬酸產(chǎn)率、生產(chǎn)強(qiáng)度最大，分別為0.35 g/g和0.33 g/(L·h)，富馬酸產(chǎn)量達(dá)到27.79 g/L，達(dá)到了根霉菌利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備富馬酸的最高轉(zhuǎn)化率。此后，Tai等［36］進(jìn)一步研究了半纖維素水解液中甲酸、乙酸和糠醛等抑制物組分對根霉菌生長及代謝的影響，結(jié)果表明上述抑制物組分在一定濃度范圍內(nèi)對米根霉的生物量和菌體細(xì)胞壁殼聚糖組分具有促進(jìn)作用，分別達(dá)24.5% ～37.8%和60.1% ～207.1%，最大時(shí)增長量可達(dá)2倍之多。這一結(jié)果表明根霉菌可利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)富馬酸，還可以通過聯(lián)產(chǎn)殼聚糖來解決木糖的高效利用。

5 非鈣鹽中和工藝的開發(fā)

傳統(tǒng)的富馬酸發(fā)酵過程需要添加CaCO3作為中和劑，維持發(fā)酵液pH4.5～5.5。35℃時(shí)，富馬酸鈣的溶解度約是2.5%，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，發(fā)酵液中的固態(tài)部分，包括菌體、CaCO3、富馬酸鈣等，逐漸轉(zhuǎn)變成固態(tài)凝膠狀，由于富馬酸逐漸釋放到胞外，在細(xì)胞表面與CaCO3接觸后生成的富馬酸鈣會(huì)逐漸包裹住細(xì)胞，抑制細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及傳質(zhì)傳氧;發(fā)酵結(jié)束后，需要添加H2SO4來中和過量的CaCO3并回收產(chǎn)物，從而產(chǎn)生大量的廢渣(CaSO4)和廢水，環(huán)保壓力較大。因此，替換鈣鹽工藝成為一種趨勢。

5.1 替換中和劑

Zhou等［37］對中和劑包括 NaHCO3、Na2CO3、Ca(OH)2、(NH4)2CO3以及 KOH與 K2CO3的混合物等均做了考察，希望在維持或達(dá)到更高富馬酸生產(chǎn)效率的同時(shí)獲得更高溶解度的富馬酸鹽，更有利于下游的富馬酸分離提取工藝，并減少能耗。例如，分別以鈉鹽和銨鹽為中和劑時(shí)，如果將富馬酸發(fā)酵與下游的L-蘋果酸和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化工藝相結(jié)合，就可以通過直接濃縮發(fā)酵液中的富馬酸鈉或富馬酸銨為原料，從而減少工藝步驟。但采用這些中和劑時(shí)，富馬酸產(chǎn)率較低，其中使用Ca(OH)2時(shí)的富馬酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別只有原來的32.3%和25.2%。造成這種差距的原因可能是使用CaCO3做中和試劑時(shí)，它與富馬酸反應(yīng)能產(chǎn)生更多可溶性的CO2，從而促進(jìn)了丙酮酸羧化反應(yīng)，這與前面分析過的富馬酸合成機(jī)制是一致的。用Na2CO3或NaHCO3做中和試劑時(shí)，富馬酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度同樣比用CaCO3要低，可能原因有:①Na+對細(xì)胞代謝機(jī)制產(chǎn)生了影響;②富馬酸鈉鹽的溶解度比富馬酸鈣高，對發(fā)酵過程產(chǎn)生了一定的產(chǎn)物反饋抑制作用。更換中和劑導(dǎo)致富馬酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)速率降低，使得相關(guān)工藝缺乏技術(shù)經(jīng)濟(jì)性。

5.2 反應(yīng)分離耦合技術(shù)

開發(fā)一種不需要使用中和試劑、同時(shí)能避免產(chǎn)物抑制的高產(chǎn)率工藝，將顯著改善整個(gè)富馬酸發(fā)酵工藝的經(jīng)濟(jì)性，采用發(fā)酵分離耦合技術(shù)(又稱原位分離技術(shù)，ISPR)可能是解決該問題的有效途徑。

Roa Engel［38］研究了發(fā)酵與冷卻結(jié)晶工藝整合制備富馬酸的技術(shù)，以NaOH為中和劑，同時(shí)通入10%左右的CO2，控制發(fā)酵體系pH相對較低(pH 3.5)，發(fā)酵罐中富馬酸質(zhì)量濃度可達(dá)20 g/L左右，經(jīng)過濾，菌體的發(fā)酵液進(jìn)入冷卻結(jié)晶罐(0～5℃)，部分富馬酸被結(jié)晶析出(4～5 g/L)。顯然，該策略的順利實(shí)施尚有難度。進(jìn)一步通過模擬計(jì)算，總結(jié)出發(fā)酵與冷卻結(jié)晶工藝整合技術(shù)的瓶頸在于能否采用更低的發(fā)酵pH(如pH3.0)，因此，提升根霉菌對高酸性發(fā)酵環(huán)境的耐受性成為該工藝實(shí)施的前提。

Cao等［39］采用生物被膜轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器固定化米根霉細(xì)胞，以樹脂Amberlite IRA -900為分離載體，同步發(fā)酵-吸附分離制備富馬酸，獲得了最高的富馬酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)速率，在20 h內(nèi)能將100 g/L葡萄糖發(fā)酵生成富馬酸85 g/L，生產(chǎn)速率高達(dá)4.25 g/(L·h)。樹脂Amberlite IRA -900吸附的富馬酸可用NaCl洗脫，由于富馬酸溶解度較低(25℃，低于5 g/L)，洗脫液用鹽酸酸化后即可得到純度近乎100%的富馬酸晶體。該系統(tǒng)的主要特色在于生物被膜轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器，固定于轉(zhuǎn)盤上的米根霉細(xì)胞能維持活力達(dá)兩周，但該系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

針對轉(zhuǎn)盤反應(yīng)器的缺點(diǎn)，筆者所在課題組開展了攪拌式反應(yīng)器發(fā)酵與離子交換樹脂分離耦合制備富馬酸的研究［40］。通過對自固定化米根霉在攪拌式反應(yīng)器中的菌球形態(tài)控制的研究［41］，以及基于耦合體系的離子交換樹脂分離工藝的優(yōu)化［42］，富馬酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和富馬酸生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了58.6 g/L、76.4%和1.72 g/(L·h)。以 NaOH 洗脫樹脂，富馬酸的洗脫濃度仍較低;富馬酸的結(jié)晶還需增加酸化工藝，且將洗脫收集的富馬酸鈉用于L-蘋果酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)，還需進(jìn)一步濃縮。

針對樹脂洗脫液中富馬酸鹽濃度低的問題，筆者所在課題組進(jìn)一步開發(fā)了絡(luò)合萃取與發(fā)酵過程耦合生產(chǎn)富馬酸的工藝［43］，在攪拌反應(yīng)器中培養(yǎng)根霉菌，發(fā)酵液過濾去除菌體后泵入逆流萃取塔，萃取劑為叔胺、季銨混合物，萃余液經(jīng)兩級溶劑捕集去除細(xì)胞毒性后返回發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的pH調(diào)控由萃取發(fā)酵自動(dòng)調(diào)節(jié)，發(fā)酵周期 60 h，糖轉(zhuǎn)化率50.8%，生產(chǎn)速率為1.0～1.1 g/(L·h)。反萃后富馬酸銨或富馬酸鈉質(zhì)量濃度達(dá)150 g/L，可作為底物用于L-天冬氨酸或L-蘋果酸的酶法轉(zhuǎn)化。該體系與樹脂耦合體系相比，最大優(yōu)勢在于萃取過程具有濃縮富集作用，大幅降低了工藝能耗，促進(jìn)了富馬酸與下游衍生物的技術(shù)集成。

6 展望

隨著食品、醫(yī)藥等高端應(yīng)用市場對高品質(zhì)、純天然原料需求的增加，利用生物法生產(chǎn)富馬酸因其工藝簡單、過程可控，產(chǎn)品天然無毒，安全性及品質(zhì)得到保障，市場前景廣闊。因此，加大生物法制備富馬酸的工程技術(shù)研究，選育優(yōu)良菌株并優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)速率，完善富馬酸及其衍生物如L-蘋果酸、L-天冬氨酸的技術(shù)集成，進(jìn)一步降低生物基富馬酸的制造成本，將大幅推動(dòng)市場發(fā)展。

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