抑制葡糖腦苷脂酶對(duì)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)α-突觸核蛋白寡聚體形成及細(xì)胞自噬功能的影響

劉光偉 尹 娜 彌 娜 李 昕 李堯華 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053;2.北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

α－突觸核蛋白(α－synuclein，α－Syn)是由 140 個(gè)氨基酸組成的酸性蛋白質(zhì)，其纖維化過程中形成的可溶性寡聚體中間體被認(rèn)為在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病中起著重要作用［1］。然而，導(dǎo)致 α－Syn寡聚體在神經(jīng)元內(nèi)積聚的機(jī)制仍不十分清楚。近年來的研究表明，α－Syn寡聚體的形成及其在神經(jīng)元內(nèi)的積聚與其降解通路發(fā)生障礙有關(guān)。α－Syn的降解主要通過伴侶分子介導(dǎo)的自噬(chaperone mediated autophagy，CMA)進(jìn)行［2］，而 CMA 對(duì) α－Syn 的降解需要葡糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase，GBA)的正?；钚裕?－4］。GBA的基因突變不僅可以促進(jìn)溶酶體貯存障礙的疾病——戈謝病(Gaucher’s disease)發(fā)生，而且其某些突變(N370S、L444P)可以引起PD以及明顯的路易體病變［5－6］。另有證據(jù)表明，GBA 突變攜帶者腦組織中的a－Syn寡聚體含量增加，而PD患者腦組織中的GBA活性和表達(dá)均降低［7－9］。這些研究結(jié)果提示GBA和α－Syn可能存在某種相互作用。筆者推測(cè)，GBA的活性下降很可能是導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)α－Syn寡聚體增加并進(jìn)一步引起細(xì)胞自噬異常的原因，后者可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。

在本研究中，筆者將利用MES23.5多巴胺神經(jīng)細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察抑制GBA活性后細(xì)胞內(nèi)α－Syn寡聚體含量的變化及其對(duì)自噬活性、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

MES23.5多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞由美國(guó)休斯敦Baylor醫(yī)學(xué)院樂衛(wèi)東教授惠贈(zèng)。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO Invitrogen公司;胎牛血清購(gòu)自Berlin公司;重組人α－Syn 蛋白由本室制備［11］;環(huán)己烯四醇－β－環(huán)氧化物(conduritol－β－epoxide，CβE)購(gòu)自 Calbiochem 公司;GBA活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BioAssay Systems公司;Cyto－ID○R自噬檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Enzo Life Sciences公司;超氧化物陰離子熒光探針(DHE)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;丫靛橙和碘化丙啶購(gòu)自Sigma－Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MES23.5細(xì)胞培養(yǎng)

MES23.5多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞接種于鋪有多聚－L－賴氨酸的25 cm2培養(yǎng)瓶中，在含有5% 胎牛血清和Sato’s添加液的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)［11］。待細(xì)胞增生到適當(dāng)密度后，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需要，接種于鋪有多聚－L－賴氨酸的24孔板或35 mm2培養(yǎng)皿中。

1.2.2 培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白的提取

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗3次。收集細(xì)胞，4℃、10 000 r/min離心3 min。棄上清，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS清洗沉淀，4℃、10 000 r/min離心3 min。棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入200 μL細(xì)胞提取液(50 mmol/L Tris－HCl pH 7.4，150 mmol/L NaCl，2%TritonX－100，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA)，混勻后冰上放置40 min。4℃、10 000 r/min離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 GBA活性的測(cè)定

按照GBA酶活性檢測(cè)試劑盒要求的方法操作。準(zhǔn)備一個(gè)96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備相應(yīng)體積的工作液:200 μL檢測(cè)緩沖液+8 μL底物液/孔。在96孔板中分別加入超純水、校準(zhǔn)液、樣品和準(zhǔn)備好的工作液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處反應(yīng)前(0 min)的吸光度值。50℃水浴30 min后再次測(cè)定405 nm處吸光度值。GBA酶活性=〔(OA 30 min－OA 0 min)/(OA標(biāo)準(zhǔn)液－OA 水)〕×250(U/L)。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)α－Syn寡聚體的檢測(cè)

依據(jù)參考文獻(xiàn)［12］所述原理，利用特殊的ELISA方法檢測(cè)α－Syn寡聚體。首先，用3D5小鼠抗人α－Syn單克隆抗體［13］(1 μg/mL)包被酶標(biāo)板，4 ℃ 過夜。然后用2%牛血清白蛋白封閉，37℃孵育2 h，加入事先制備好的不同質(zhì)量濃度α－Syn寡聚體及待檢測(cè)樣品，100 μL/孔，于37℃孵育2 h。加入生物素化3D5抗體稀釋至1 μg/mL，37℃孵育2 h。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素抗體(1/20 000)，37℃孵育1 h。以上每次反應(yīng)結(jié)束后用PBST洗4次，每次5 min。最后加入對(duì)硝基酚磷酸顯色液(pNpp)，37℃孵育30 min。測(cè)定405 nm處吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞自噬活性的測(cè)試

提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。按說明配制洗滌液(1×assay buffer)和檢測(cè)工作液(每1 mL 完全培養(yǎng)基加 2 μL Cyto－ID○R和 1 μL Hoechst 33342 Nuclear Stain)。操作步驟按照 Cyto－ID○R自噬檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的測(cè)試

將DHE溶解于DMSO，配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的母液，將其直接添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中，濃度為10 μmol/L，37℃避光孵育30 min進(jìn)行熒光探針裝載，隨后用PBS洗滌3次。在熒光顯微鏡下(放大200倍)觀察結(jié)果。每孔隨機(jī)取3個(gè)無重疊視野拍照，觀察熒光強(qiáng)度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 凋亡細(xì)胞的檢測(cè)

應(yīng)用AO/PI染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞用96孔板培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸棄各孔培養(yǎng)基，用PBS洗凈細(xì)胞，加入50 μL AO染料，37℃溫孵10 min后，再加入50 μL PI染料，繼續(xù)溫孵10 min。每次反應(yīng)結(jié)束后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下(放大200倍)觀察結(jié)果。每孔隨機(jī)取至少3個(gè)無重疊視野拍照計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉx±SE)表示，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測(cè)試以及凋亡細(xì)胞的檢測(cè)使用析因方差分析法進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)使用單因素方差(ANOVA)分析法進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)α-Syn寡聚體形成的影響

首先測(cè)試了不同質(zhì)量濃度(12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L)的 GBA 活性抑制劑——CβE 對(duì) GBA活性的影響。用CβE處理MES23.5細(xì)胞48 h后測(cè)定GBA活性。結(jié)果顯示，GBA活性隨著CβE質(zhì)量濃度的增加而下降(圖1)。在另一組細(xì)胞，觀察了CβE對(duì)α－Syn寡聚體形成的影響。細(xì)胞首先用不同濃度的CβE處理48 h后，然后將 α－Syn單體(1 μmol/L)添加到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h使其進(jìn)入細(xì)胞。然后提取細(xì)胞總蛋白，利用ELISA方法檢測(cè)α－Syn寡聚體的含量。結(jié)果顯示，12.5 μmol/L的 CβE可以引起細(xì)胞內(nèi)的α－Syn寡聚體顯著增加，隨著 CβE濃度的加大，α－Syn寡聚體的含量也進(jìn)一步增多(圖2)。

圖1 CβE抑制細(xì)胞GBA活性Fig.1 CβE Inhibits GBA activity

2.2 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞自噬活性的影響

圖2 抑制GBA活性增加細(xì)胞內(nèi)α-Syn寡聚體含量Fig.2 Inhibition of GBA activity increases the amount of α-Syn oligomers in cells

將細(xì)胞分為兩組，一組用CβE(100μmol/L)處理48 h后細(xì)胞外添加不同濃度(0、1、10 μmol/L)的 α－Syn單體，另一組不用CβE處理，僅在細(xì)胞外添加不同質(zhì)量濃度α－Syn單體。48 h后測(cè)定自噬活性。在無 α－Syn 處理細(xì)胞，未見自噬活性改變，1 μmol/L α－Syn引起個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)自噬體，而增加α－Syn至10 μmol/L可以使自噬體數(shù)量有所增加。CβE本身可以誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn)，在存在α－Syn的情況下，其誘導(dǎo)的自噬體的數(shù)量進(jìn)一步增多。與沒有CβE處理的細(xì)胞相比較，CβE處理細(xì)胞的自噬體的數(shù)量明顯增多(圖3)。

2.3 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

細(xì)胞分組和處理方法同上。細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平通過使用DHE活性氧探針檢測(cè)(圖4)。結(jié)果顯示，在無CβE處理組細(xì)胞，隨著添加的α－Syn量的增多，氧化應(yīng)激水平增高，但只有當(dāng)α－Syn濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)，氧化應(yīng)激水平變化才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在CβE處理細(xì)胞，氧化應(yīng)激水平也隨著α－Syn濃度加大而逐漸加大，但其變化幅度明顯大于無CβE處理細(xì)胞，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

AO/PI染色結(jié)果顯示，在不做任何處理的正常細(xì)胞，所有細(xì)胞被染成綠色，沒有紅染的細(xì)胞出現(xiàn)，提示沒有產(chǎn)生凋亡細(xì)胞。在單純?chǔ)粒璖yn(1 μmol/L和)處理細(xì)胞，雖然大多數(shù)呈綠色，但可見部分細(xì)胞被染成紅色，紅染的細(xì)胞在10 μmol/L α－Syn處理組明顯多于1 μmol/L處理組。在單純CβE處理組也未見明顯的呈紅染的凋亡細(xì)胞，而在CβE和α－Syn雙重處理的細(xì)胞，紅染的凋亡細(xì)胞明顯增多，其數(shù)量在10 μmol/L α－Syn處理組明顯多于1 μmol/L處理組(圖5)。

圖3 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞巨自噬活性的影響Fig.3 Effect of GBA activity inhibition on macroautophagic activity

圖4 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響Fig.4 Effect of GBA activity inhibition on ROS levels

3 討論

本研究利用培養(yǎng)MES23.5多巴胺神經(jīng)細(xì)胞研究了抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)α－Syn寡聚體形成的影響。鑒于MES23.5多巴胺神經(jīng)細(xì)胞是由小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤和大鼠中腦多巴胺神經(jīng)細(xì)胞雜交而成，表達(dá)極少量的鼠源性α－Syn，筆者將重組人α－Syn加入到培養(yǎng)基，利用該蛋白能夠迅速以被動(dòng)擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞并不被蛋白降解系統(tǒng)分解的特性，使其進(jìn)入細(xì)胞［14］。與基因轉(zhuǎn)染方法相比較，這種方法可以控制細(xì)胞內(nèi)α－Syn的含量，有助于觀察在細(xì)胞內(nèi)α－Syn含量不同的情況下，抑制GBA活性對(duì)α－Syn寡聚體形成的影響。利用這個(gè)細(xì)胞模型，筆者首先觀察了GBA活性抑制劑CβE對(duì)α－Syn寡聚體形成的影響。結(jié)果表明，CβE引起濃度依賴的GBA活性下降和細(xì)胞內(nèi)的α－Syn寡聚體增多。這一結(jié)果提示，GBA活性下降是細(xì)胞內(nèi)α－Syn寡聚體增多的原因。

圖5 抑制GBA活性對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of GBA activity inhibition on apoptotic rates

已知，細(xì)胞內(nèi)的自噬系統(tǒng)包括微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和伴侶分子介導(dǎo)的自噬(CMA)［15］。正常情況下，α－Syn 通過伴侶分子介導(dǎo)的自噬(CMA)降解。抑制GBA活性將削弱伴侶分子介導(dǎo)的自噬(CMA)介導(dǎo)的α－Syn降解，并導(dǎo)致α－Syn寡聚體增加，而聚集的α－Syn寡聚體不能有效地通過伴侶分子介導(dǎo)的自噬(CMA)降解［16］。然而，巨自噬在清除細(xì)胞內(nèi)的 α－Syn寡聚體中發(fā)揮重要作用［17］。因此，筆者進(jìn)一步觀察了在GBA活性被抑制的情況下，自噬活性的變化。筆者用100 μmol/L CβE抑制GBA活性。這一濃度的CβE可以使GBA活性下降60%，與GBA突變引起的PD患者黑質(zhì)GBA活性的下降程度相當(dāng)［18］。筆者發(fā)現(xiàn)，在單純用α－Syn處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)幾乎不出現(xiàn)自噬體，而在GBA活性被抑制的情況下用α－Syn處理細(xì)胞時(shí)，則很多細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體，并且自噬體的數(shù)量隨α－Syn濃度的增加而增加。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因很可能是正常情況下α－Syn在進(jìn)入細(xì)胞后能夠迅速而有效地被CMA或泛素－蛋白酶體途徑降解，而在GBA活性受抑制時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)α－Syn寡聚體含量的增加激活了細(xì)胞的巨自噬系統(tǒng)。α－Syn寡聚體含量增加激活巨自噬的機(jī)制之一很可能是其引起細(xì)胞內(nèi)的活性氧增加。以往的研究表明，α－Syn寡聚體可以增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧，后者被證明對(duì)巨自噬具有刺激作用。作為這一推測(cè)的證據(jù)，筆者發(fā)現(xiàn)在用α－Syn和CβE同時(shí)處理細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)的活性氧增加。

盡管巨噬活性的代償性增強(qiáng)有助于α－Syn寡聚體的清除，但過度的巨噬活性增強(qiáng)也將對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，引起自噬性細(xì)胞死亡(autophagic cell death)。因此，導(dǎo)致α－Syn和CβE處理細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一很可能與過度的巨自噬活性增強(qiáng)有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)揭示自噬功能改變引起PD神經(jīng)退變的機(jī)制具有重要意義。

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