羥基紅花黃色素A對腦缺血再灌注大鼠MMP-9和claudin-5蛋白水平的影響

戚智鋒 師文娟 閆 峰 羅玉敏 劉克建

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京100053)

紅花是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是中藥紅花的主要有效成分之一，存在于紅花的水溶性提取部位，目前廣泛用于心血管疾病的臨床治療［1］。近年來國內(nèi)外基礎(chǔ)研究［2-4］發(fā)現(xiàn)，HSYA具有抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集、抗血栓形成等多種藥理學(xué)功效，可以有效降低動(dòng)物腦缺血損傷。紅花黃色素不僅可有效降低缺血再灌注時(shí)ATP合成障礙，還可以增加腺苷酸儲備，因而調(diào)節(jié)能量代謝，達(dá)到保護(hù)缺血心肌組織的作用［5］。紅花黃色素可有效降低缺血再灌注時(shí)ATP合成障礙，增加腺苷酸儲備，因而有利于能量代謝障礙的恢復(fù)，達(dá)到保護(hù)缺血心肌組織的作用。紅花黃色素對自由基有顯著的清除能力，隨紅花黃色素劑量加大，對自由基的消除作用逐步增強(qiáng)［6］。

血腦脊液屏障是腦微血管特有的屏障結(jié)構(gòu)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是形成屏障作用的最主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接蛋白(包括claudin-5、occludin等)的水平直接影響血腦脊液屏障通透性;腦缺血時(shí)這些蛋白水平減少，表明血腦脊液屏障結(jié)構(gòu)受到破壞，血腦脊液屏障通透性增加，加重腦水腫或出血?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-9，MMPs)是一組鋅依賴的蛋白水解酶，其中MMP-9可以直接降解內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白(如claudin-5)，具有底物特異性。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)［7］顯示，缺血再灌注促進(jìn)MMP-9活性增強(qiáng)，破壞了神經(jīng)血管基質(zhì)，從而破壞了血腦脊液屏障的完整性。

研究［2］表明，HSYA可以減輕大鼠腦缺血引起的血腦脊液屏障通透性增加，如減少染料Evan’s blue的漏出等。但是，HSYA減輕血腦脊液屏障通透性的確切機(jī)制還不清楚。本研究將利用大鼠缺血1.5 h再灌注72 h模型，研究HSYA對腦缺血后半影區(qū)和核心區(qū)MMP-9和claudin-5蛋白水平的影響，探討HSYA減輕血腦脊液屏障通透性的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 大腦中動(dòng)脈阻塞模型制作

雄性SD大鼠，體質(zhì)量290～310 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SCXK(京)2012-0001。用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血1.5 h再灌注72 h模型。詳細(xì)操作方法參見文獻(xiàn)［8］。

1.2 給藥治療

HSYA由浙江永寧藥業(yè)有限公司提供，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，HSYA治療組和鹽水對照組，每組3只。紅花黃色素分4次尾靜脈注射，每次2 mg/kg，濃度參考文獻(xiàn)［3］。注射時(shí)間點(diǎn)為缺血后30 min、再灌注時(shí)、再灌注24 h、再灌注48 h。對照組(Saline):給予同體積0.9%氯化鈉注射液，其余與HSYA組相同。在72 h后處死動(dòng)物，進(jìn)行后續(xù)檢測。

圖1 HSYA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of HSYA

1.3 TTC染色及取材

大鼠斷頭取腦后，自額葉后3 mm處開始連續(xù)切取腦片4片，每片厚度2 mm，用1.5%TTC染色10 min，拍照。半影區(qū)和缺血核心區(qū)的確定參考文獻(xiàn)［9-10］。取材方法簡述如下。半影區(qū)為尚未發(fā)生梗死區(qū)域，TTC染色顯示為紅色;缺血核心區(qū)為梗死區(qū)域，TTC顯示為白色。每只大鼠均選取第2張腦片，分別取半影區(qū)和缺血核心區(qū)的皮質(zhì)組織進(jìn)行Western blotting檢測，取材如圖2。

圖2 半影區(qū)和缺血核心區(qū)的確定及取材示意圖Fig.2 Definition of penumbra and ischemic core and illustration of tissue collection

1.4 Western blotting 檢測

詳細(xì)操作方法參見文獻(xiàn)［8］。簡述如下。腦組織中加入RAPI細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl，pH 7.4，150 mmol/L sodium chloride，1% NP-40，0.1%SDS)中，按比例100∶1加入復(fù)合磷酸酶抑制劑和復(fù)合蛋白酶抑制劑。勻漿后超聲，4℃，12 000 g，離心10 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍字屑尤隠oading Buffer，95℃變性 5 min，進(jìn)行 10%SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。10%牛奶封閉1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min;分別加入羊抗小鼠MMP-9一抗(1∶1 000，Sigma公司，美國)、claudin-5一抗(1 ∶1 000，Sigma公司，美國)或羊抗兔 β-actin(1∶2 000，Sigma公司，美國)，室溫孵育4 h。吸出一抗孵育液，以TTBS漂洗3次，每次10 min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗，室溫下與雜交膜孵育1 h。棄去二抗，TTBS漂洗3次，每次10 min;ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影，使用Gel-Del凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。蛋白水平用目標(biāo)蛋白條帶灰度與β-actin的比值，以對照組的比值作為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(ˉx±SE)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSYA降低腦梗死面積

TTC染色結(jié)果顯示，HSYA組的腦梗死面積小于Saline對照組，白色顯示腦梗死區(qū)域，紅色顯示尚未發(fā)生梗死區(qū)域。典型TTC染色如圖3所示。

2.2 HSYA降低半影區(qū)MMP-9蛋白水平，不影響核心區(qū)MMP-9蛋白水平

Western blotting檢測HSYA組和Saline組半影區(qū)和核心區(qū)MMP-9蛋白水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，HSYA處理組MMP-9蛋白水平顯著低于鹽水對照組(Saline 組:100±0.00，HSYA 組:63.38±12.23，每組n=3，P＜0.05，圖 4);而在缺血核心區(qū)，HSYA 組和 Saline 組MMP-9蛋白水平?jīng)]有明顯變化(Saline組:100±0.00，HSYA 組:104.66±12.99，每組 n=3，P＞0.05，圖5)。

2.3 HSYA增加半影區(qū)claudin-5蛋白水平，不影響核心區(qū)claudin-5蛋白水平

圖3 TTC染色結(jié)果Fig.3 TTC staining

圖4 Western blotting檢測半影區(qū)MMP-9蛋白水平Fig.4 Results of Western blotting of MMP-9 in penumbra

Western blotting檢測HSYA組和Saline組半影區(qū)和核心區(qū)claudin-5蛋白水平，結(jié)果顯示與對照組相比，HSYA處理組claudin-5蛋白水平顯著高于鹽水對照組(Saline 組:100，HSYA 組:129±10.5，n=3，P＜0.05，圖6)。而在缺血核心區(qū)，HSYA組和Saline組claudin-5蛋白水平?jīng)]有明顯變化(Saline組:100，HSYA 組:95.47±15.47，n=3，P＞0.05，圖 7)。

圖5 Western blotting檢測缺血核心區(qū)MMP-9蛋白水平Fig.5 Results of Western blotting of MMP-9 in ischemic core

圖6 Western blotting檢測缺血核心區(qū)claudin-5蛋白水平Fig.6 Results of Western blotting of claudin-5 in penumbra

圖7 Western blotting檢測缺血核心區(qū)claudin-5蛋白水平Fig.7 Results of Western blotting of claudin-5 in ischemic core

3 討論

中風(fēng)以其高發(fā)病率和高致殘率成為當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病。而水腫、出血等合并癥是腦缺血疾病致死和致殘的主要原因［11］，因此如何降低腦缺血合并癥的發(fā)生是降低腦缺血病死率和致殘率的關(guān)鍵。人們對腦缺血繼發(fā)水腫、出血發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識由宏觀到微觀，最終歸于血腦脊液屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞［12］。因此，探討腦缺血早期血腦脊液屏障損傷的機(jī)制，有助于尋找防治血腦脊液屏障損傷的臨床手段，從而降低腦缺血合并癥的發(fā)生。

血腦脊液屏障主要是腦組織微血管屏障結(jié)構(gòu)，以保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義［13］。緊密連接蛋白為跨膜蛋白，是形成內(nèi)皮細(xì)胞間屏障的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括claudins等。這些蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白相連接，與內(nèi)皮細(xì)胞共同形成完整的屏障結(jié)構(gòu)，阻礙水溶性分子及離子通過血腦脊液屏障［14-15］。如果這些蛋白水平下降、分布或功能異常將導(dǎo)致血腦脊液屏障通透性增高。而基質(zhì)金屬蛋白酶作為腦組織內(nèi)重要的蛋白水解酶，可以直接降解緊密連接及血管基底膜、細(xì)胞基質(zhì)等，破壞血腦脊液屏障結(jié)構(gòu)、增加通透性［16-17］。

HSYA是傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花的主要有效成分之一，可以有效減輕心臟缺血性損傷，在我國已經(jīng)廣泛用于心血管病的臨床治療(國藥準(zhǔn)字Z20050146)。近來國內(nèi)外研究［4］顯示，HSYA可以有效降低血栓形成、血小板聚集;降低急性缺血再灌注大鼠腦梗死體積，改善行為學(xué)評分［3］。HSYA還可以增加腦組織SOD活性和降低脂質(zhì)過氧化，降低腦組織線粒體ROS水平，從而減輕腦組織氧化損傷［2，18］。研究［2］表明，HSYA可以減輕大鼠腦缺血引起的血腦脊液屏障通透性增加，如減少染料Evan’s blue的漏出等。但是，HSYA減輕血腦脊液屏障通透性的機(jī)制還不清楚。

研究［19-20］顯示，腦缺血時(shí)MMPs活性與血腦脊液屏障通透性的時(shí)程變化密切相關(guān)。腦缺血1 h，血腦脊液屏障通透性就開始增加，在1～2 d后會出現(xiàn)更嚴(yán)重的二次開放，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［21-22］顯示，腦缺血2～4 h，MMP-9前體表達(dá)及酶活性即明顯增高，在24 h達(dá)高峰并持續(xù)5 d。應(yīng)用MMP-9特異性抑制劑或MMP-9基因敲除動(dòng)物，在一定程度上對缺血損傷的耐受能力增加，血腦脊液屏障的損傷程度也有所減輕。

本研究利用大鼠缺血1.5 h再灌注72 h模型，發(fā)現(xiàn)HSYA處理可以減少半影區(qū)MMP-9蛋白水平，增加claudin-5的蛋白水平，提示HSYA有可能通過降低半影區(qū)MMP-9蛋白水平，并減少M(fèi)MP-9對其底物claudin-5的降解。在缺血半影區(qū)內(nèi)，由于側(cè)支循環(huán)存在，仍可獲得部分血液供給，神經(jīng)細(xì)胞功能雖受損但短期內(nèi)尚存活，處于可逆狀態(tài)，如在有效時(shí)間內(nèi)及時(shí)恢復(fù)血液供應(yīng)，則腦代謝障礙得以恢復(fù)，神經(jīng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞可以存活并可恢復(fù)功能［9］。本實(shí)驗(yàn)中HSYA治療方案可能有助于減輕半影區(qū)血腦脊液屏障損傷。

但是，本研究顯示，HSYA對缺血核心區(qū)MMP-9和claudin-5的影響與半影區(qū)的影響有所不同，即HSYA并不顯著改變?nèi)毖诵膮^(qū)MMP-9和claudin-5蛋白水平。筆者推測，這可能是由于缺血中心區(qū)腦血流量嚴(yán)重不足或完全缺血，導(dǎo)致中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，不可逆轉(zhuǎn)地進(jìn)入死亡程序。因此，即便給予干預(yù)措施，也不會產(chǎn)生如同半影區(qū)組織那樣的保護(hù)效果。

總之，本研究用大腦中動(dòng)脈阻塞模型證明，活血化瘀中藥HSYA可能通過減少半影區(qū)MMP-9蛋白水平，提高claudin-5的水平，從而減少半影區(qū)血腦脊液屏障損傷，為深入的研究HSYA的血腦脊液屏障保護(hù)作用機(jī)制提供了參考。

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