硫脲殼聚糖銅配合物與鯡魚精DNA相互作用的研究

李小芳，馮小強*，楊 聲

1天水師范學(xué)院生化學(xué)院，天水 741001;2定西師專，定西 743000

DNA是生命中重要的遺傳物質(zhì)，同時也是很多藥物的靶點。藥物與DNA相互作用的研究不僅有助于揭示藥物的作用機理，同時對于新藥的研發(fā)也具有重要的意義［1］。銅離子具有抗炎、殺菌、抗癌、抗凝血等藥理作用。許多生物酶都依靠與銅元素的反應(yīng)來激發(fā)活性，從而完成在生物體中對新陳代謝過程的催化作用。因此，銅配合物的合成及生物活性的研究成為一個焦點領(lǐng)域。硫脲殼聚糖銅(Thiourea-chitosan-Cu，簡稱 TUCS-Cu)，對 E．coli和 St．a(chǎn)ureus具有顯著的抑菌性能［2］。為了揭示其抑菌機理，探討TUCS-Cu與DNA作用模式及其生物活性之間的關(guān)系，有助于人們對TUCS-Cu與DNA相互作用方式的理解，同時在分子和細胞水平上研究病因?qū)ふ揖哂锌鼓[瘤活性的藥物有著重要的意義［3］，為研究TUCS-Cu在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

TUCS-Cu(制備方法見參考文獻［2］)，用 1.0%(v/v)HAc溶解;鯡魚精DNA美國Sigma公司產(chǎn)品，配制0.1 mg/mL貯備液備用。UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津);CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華)。

1.2 實驗方法

1.2.1 循環(huán)伏安行為

實驗在單室電解池中進行，三電極系統(tǒng):工作電極為玻碳電極(GCE)，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑絲電極。

1.2.2 紫外吸收光譜

在1 cm×1 cm比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液 4 mL，用 TUCS-Cu滴定，搖勻，放置 5 min，以試劑空白為參比，掃描吸收光譜。滴定時每次加入體積為5 μL。

1.2.3 熒光光譜

比色皿中加入0.1 mg/mL的DNA溶液3 mL和NR溶液0.05 mL，用TUCS-Cu溶液進行滴定，以550 nm為激發(fā)波長，EX=EM=5 nm，測定熒光光譜。滴定時每次加入體積為5 μL。

1.2.4 粘度測定

DNA溶液粘度用烏氏粘度計測定，測定時固定DNA濃度為0.1 mg/mL，以不同的R(CTUCS-Cu/CDNA)加入配合物，溫度恒定在25℃，作用30 min進行測量，得到(η/η0)1/3與配合物濃度關(guān)系。η為 DNA溶液在加入配合物時的粘度，η0為DNA溶液的粘度。

2 結(jié)果與討論

2.1 TUCS-Cu與DNA作用的循環(huán)伏安行為

圖1 掃速對TUCS-Cu電化學(xué)影響Fig.1 Effect of scan rate on the electrochemistry of TUCS-Cu

在0.1v/s的掃描速度下，TUCS-Cu在-0.2V附近有一還原峰，在0.258V和0.506V處有兩個氧化峰，分別對應(yīng)于Cu(Ⅰ)和Cu(Ⅱ)的氧化峰。從不同掃描速度下獲得的循環(huán)伏安圖可見(圖1a)，氧化還原峰電流隨著掃描速度的增大而增大(0.01～0.15v/s)，并與掃描速度的平方根呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系y=1.05+8.56x(R=0.9979)(圖1b)，表明中心銅離子在電極上的反應(yīng)過程主要由擴散過程控制。

在4 mL 1.0 mg/mL的 TUCS-Cu溶液中，用DNA滴定，每次加入體積為10 μL，搖勻，放置 5 min，TUCS-Cu與DNA在稀溶液中相互作用的循環(huán)伏安曲線如圖2所示。發(fā)現(xiàn)在配合物溶液中加入DNA后，循環(huán)伏安曲線發(fā)生了明顯的變化，TUCS-Cu配合物的氧化峰電流明顯降低且沒有新的氧化還原峰出現(xiàn)，氧化還原峰電流急劇降低，且在0.506V的氧化峰電位發(fā)生正移，故峰電位差ΔE增大。Bard等提出，當(dāng)金屬配合物與DNA發(fā)生作用時，如果峰電位向負方向偏移，則金屬配合物與DNA發(fā)生靜電作用，如果峰電位向正方向偏移，則發(fā)生插入作用［4］，說明TUCS-Cu以嵌插作用與DNA分子作用形成了非電活性化合物［5］。由于該非電活性化合物在電極上沒有電化學(xué)響應(yīng)，而配合物與DNA相互作用導(dǎo)致溶液中游離配合物分子的濃度降低，使得單位時間內(nèi)遷移到電極表面的配合物分子數(shù)量減少或擴散速度減小，從而導(dǎo)致峰電流減小。

圖2 TUCS-Cu與DNA作用的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammetry figure of TUCS-Cu with DNA

2.2 TUCS-Cu與DNA相互作用的紫外吸收光譜

加入TUCS-Cu后，DNA體系的吸收光譜如圖3所示。DNA在258 nm處有最大吸收峰，TUCS-Cu對DNA吸收光譜產(chǎn)生了明顯的增色效應(yīng)，且最大吸收波長紅移至275 nm附近，說明TUCS-Cu與DNA發(fā)生了相互作用。根據(jù)Long理論，增色效應(yīng)，最大吸收波長發(fā)生紅移是該物質(zhì)與DNA發(fā)生嵌插作用的標(biāo)志［6］。明顯的增色效應(yīng)說明TUCS-Cu與堿基對之間的距離很近，即TUCS-Cu可能插入到DNA的堿基對中，從而引起DNA堿基對與嵌插的TUCSCu分子間產(chǎn)生較強的電子相互作用。

圖3 TUCS-Cu對DNA紫外吸收光譜的影響Fig.3 Effect of TUCS-Cu on the UV absorption spectra of DNA

圖4 TUCS-Cu對NR-DNA熒光光譜的影響Fig.4 Effect of TUCS-Cu on the fluorescence spectra of NR-DNA

2.3 TUCS-Cu與DNA相互作用的熒光光譜

中性紅(NR)為一共軛平面稠環(huán)分子，能專一性地插入DNA雙螺旋的堿基對之間，使熒光顯著增強。TUCS-Cu存在下DNA-NR體系熒光強度的變化如圖5所示。TUCS-Cu在此條件下無熒光，TUCS-Cu對DNA-NR體系熒光具有增強效應(yīng)。熒光通常是發(fā)生于具有剛性平面結(jié)構(gòu)的π-電子共軛的分子中，隨著π-電子共軛度和分子平面度的增大，熒光效率也將增強。分子共平面性越大，π-電子共軛度越大;即任何有益于提高π-電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率。說明TUCS-Cu的熒光與NR類似，它能專一地嵌入DNA雙螺旋的堿基對之間，使熒光顯著增強，進一步說明了TUCS-Cu是以插入方式與DNA發(fā)生作用。

2.4 DNA溶液的粘度

圖5 不同濃度TUCS-Cu對DNA粘度的影響Fig.5 Effects of increased amounts of TUCS-Cu on the viscosity of DNA

粘度一般被認為是確定配合物與DNA結(jié)合模式最有力的證據(jù)。當(dāng)TUCS-Cu存在時，DNA的相對粘度降低，且隨配合物濃度的增大呈現(xiàn)降低的趨勢，如圖5所示，表明TUCS-Cu與DNA發(fā)生了相互作用，這種插入方式使DNA得雙螺旋發(fā)生扭結(jié)，導(dǎo)致其粘度降低［7］。

3 結(jié)論

采用循環(huán)伏安、紫外光譜和熒光光譜法研究了TUCS-Cu與鯡魚精DNA的相互作用。結(jié)果表明，TUCS-Cu與DNA之間存在嵌插作用，而生成一種非電活性超分子復(fù)合物。

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