跨種屬研究Smad3在肝癌組織中的表達(dá)及意義*

朱伶群， 曹 驥， 盧曉旭， 李 瑗， 歐 超， 蘇建家， 楊 春△

( 1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部， 2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530021)

跨種屬研究Smad3在肝癌組織中的表達(dá)及意義*

朱伶群1,2， 曹 驥1， 盧曉旭1,2， 李 瑗1， 歐 超1， 蘇建家1， 楊 春1△

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部，2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530021)

目的研究Smad3在人、大鼠、樹(shù)鼩等不同種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達(dá)和意義，進(jìn)一步驗(yàn)證跨種屬篩選肝癌關(guān)鍵蛋白研究策略的可行性。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測(cè)人、大鼠和樹(shù)鼩的肝癌及其相應(yīng)癌旁組織以及正常肝組織中Smad3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果Smad3 mRNA在人、大鼠和樹(shù)鼩的肝癌中表達(dá)水平均低于其相應(yīng)的癌旁組織(均P<0.05)；在大鼠肝癌組織中的表達(dá)低于正常肝組織(P<0.05)；在樹(shù)鼩癌旁組織中的表達(dá)高于正常肝組織(P<0.05)；其余各組織間mRNA表達(dá)水平的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌組織中的表達(dá)水平均低于其相應(yīng)的癌旁組織及正常肝組織(均P<0.05)；在樹(shù)鼩肝癌組織中的表達(dá)水平也低于相應(yīng)的癌旁組織和正常肝組織，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；3個(gè)種屬的癌旁組織與正常肝組織比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論Smad3在人、大鼠和樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示該蛋白表達(dá)水平的改變可能在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為防治肝癌的靶分子。

跨種屬； Smad3蛋白； 肝腫瘤

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，以下簡(jiǎn)稱肝癌)是全世界和我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位于世界癌癥死亡率的第3位，而全球55%以上的肝癌患者發(fā)生在我國(guó)[1]。目前已有大量基因被報(bào)道與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，卻罕有一致認(rèn)可者?；谠诙鄠€(gè)種屬中共同表達(dá)的基因可能擁有更重要的保守功能這一認(rèn)識(shí)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已將跨種屬篩選腫瘤關(guān)鍵分子的策略應(yīng)用于多種腫瘤的研究，結(jié)果表明，在人和動(dòng)物的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中保守存在的共同改變基因，可能是誘發(fā)或促進(jìn)腫瘤的關(guān)鍵分子[2]。我們前期通過(guò)基因組富集以及Meta分析的方法，從5套不同種屬的肝癌基因表達(dá)芯片中篩選出轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因，Smad3即為其中之一[3]。Smad3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)信號(hào)分子之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，可能對(duì)肝癌起著腫瘤抑制因子的作用[4-5]。目前國(guó)內(nèi)外鮮有應(yīng)用跨種屬腫瘤基因篩選策略研究Smad3與肝癌關(guān)系的報(bào)道，Smad3基因是否為肝癌發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子還有待進(jìn)一步探討。因此，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)Smad3在人、大鼠和樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達(dá), 以研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用及意義。

材 料 和 方 法

1材料

1.1人肝及肝癌組織標(biāo)本 收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年1月～2011年12月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的50例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)和7例正常肝組織，正常肝組織來(lái)源于肝良性占位病變經(jīng)手術(shù)切除者，組織于手術(shù)取下后先經(jīng)液氮速凍再移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，肝癌病人術(shù)前均無(wú)放療化療史，患者年齡為24～70歲，中位年齡47.5歲。

1.2大鼠和樹(shù)鼩肝及肝癌組織標(biāo)本 大鼠肝癌及其相應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣0.5 cm以外，肉眼觀無(wú)特殊病變)15例,正常肝組織14例，樹(shù)鼩肝癌及其相應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣0.5 cm以外，肉眼觀無(wú)特殊病變)10例,正常肝組織10例,均為本課題組前期項(xiàng)目[6-7]所保存。所有組織均為手術(shù)切除后先經(jīng)液氮速凍然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃。

以上各組織類型標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)，見(jiàn)圖1～3，各例人和動(dòng)物的組織標(biāo)本均作Smad3 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)；其中人17例肝癌及其相應(yīng)癌旁組織和5例正常肝組織、大鼠12例肝癌及其相應(yīng)癌旁組織和3例正常肝組織、樹(shù)鼩4例肝癌及其相應(yīng)癌旁組織和3例正常肝組織作Smad3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。

Figure 1. The histopathological changes of HCC tissues (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in human (HE staining,×400).

圖1人肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學(xué)改變

Figure 2. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in rats (HE staining,×400).

圖2大鼠肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學(xué)改變

Figure 3. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (B) in tree shrews (HE staining,×400).

圖3樹(shù)鼩肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學(xué)改變

1.3主要試劑與儀器 RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。熒光定量試劑盒為TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 試劑盒。Ⅰ 抗采用兔抗Smad3多克隆抗體購(gòu)自Abcam，鼠抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，均適用于人和大鼠。Dylight680熒光標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購(gòu)自KPL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI生產(chǎn)的ABI StepOneTM，紅外熒光成像儀Odyssey為L(zhǎng)I-COR產(chǎn)品。

2方法

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)組織中Smad3 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取組織總RNA；經(jīng)微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)，A260/A280值在1.8～2.0之間為合格；以1.0%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)所提取的總RNA的完整性；取檢驗(yàn)合格的RNA，按Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成，產(chǎn)物于-20 ℃保存。應(yīng)用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件在Smad3和GAPDH的高度保守序列區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Smad3上、下游引物序列分別為5’-TGCGAGAAGGCGGTCAAG-3’和5’-CCACAGGCGGCAGTAGAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為186 bp；內(nèi)參照GAPDH上、下游引物序列分別為5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’和5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3’， 產(chǎn)物長(zhǎng)度為200 bp。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，采用20 μL反應(yīng)體系分別以Smad3和GAPDH引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系含：SYBR? Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)反應(yīng)循環(huán)。同時(shí)，分別構(gòu)建Smad3和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋拷貝數(shù)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，分析儀即顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和熔解曲線，根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本中初始mRNA相對(duì)表達(dá)量。計(jì)算各組Smad3與對(duì)應(yīng)內(nèi)參照GAPDH初始相對(duì)mRNA表達(dá)量的比值，得到肝癌組、癌旁組和正常組數(shù)據(jù)作為Smad3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI的BLAST中進(jìn)行比對(duì)。

2.2Western blotting檢測(cè)組織中Smad3蛋白表達(dá) 分別取各例組織樣本50～100 mg常規(guī)方法提取總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性，加樣至SDS-PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜；加 Ⅰ 抗(Smad3工作液濃度 1∶500，GAPDH工作液濃度1∶1 000)，過(guò)夜孵育，洗膜；加熒光 Ⅱ 抗(工作液濃度1∶7 500)，室溫避光孵育1 h，洗膜；以O(shè)dyssey紅外熒光成像儀掃描圖像，讀取灰度值。計(jì)算各組Smad3和內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值，得到肝癌組、癌旁組及正常組數(shù)據(jù)作為Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理；各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1總RNA質(zhì)量及基因測(cè)序

所有樣本總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳后成像顯示28S、18S和5S條帶清晰。測(cè)序所得序列經(jīng)BLAST比對(duì)，顯示各序列的同源性均在98%以上，即擴(kuò)增產(chǎn)物序列與設(shè)計(jì)序列基本一致。

2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

如圖4所示，Smad3和 GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線直線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.991和r=0.993，斜率(slope)分別為-3.856和-3.69。擴(kuò)增曲線均呈S型，有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期，曲線走行光滑，顯示擴(kuò)增結(jié)果理想,見(jiàn)圖5。熔解曲線峰形窄而尖，峰單一無(wú)雜峰，見(jiàn)圖6。

3Smad3mRNA在人、大鼠和樹(shù)鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，人肝癌組織Smad3 mRNA的表達(dá)量低于癌旁肝組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝癌組織Smad3 mRNA的表達(dá)量也低于正常肝組織，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；癌旁肝組織與與正常肝組織比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠肝癌組織Smad3 mRNA的表達(dá)量低于癌旁肝組織和正常肝組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌旁肝組織與正常肝組織比較，癌旁肝組織Smad3 mRNA的表達(dá)量低于正常肝組織，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。樹(shù)鼩肝癌組織及正常肝組織Smad3 mRNA的表達(dá)量均低于癌旁肝組織，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組織與正常肝組織比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖7。

4Smad3蛋白在人、大鼠和樹(shù)鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，在人、大鼠和樹(shù)鼩的肝癌組織中，Smad3蛋白的條帶明顯弱于癌旁及正常肝組織，而癌旁和正常肝組織比較則差異不明顯，見(jiàn)圖8～10。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖11，即人和大鼠肝癌組織Smad3蛋白的表達(dá)水平均顯著低于癌旁肝組織和正常肝組織(P<0.05)；樹(shù)鼩肝癌組織Smad3蛋白的表達(dá)低于癌旁和正常肝組織，但是差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；人、大鼠和樹(shù)鼩3個(gè)種屬癌旁組織的Smad3蛋白表達(dá)水平與正常肝組織比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 4. Real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) standard curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖4Smad3和GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

Figure 5. RFQ-PCR amplification plot of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖5Smad3和GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量-PCR擴(kuò)增曲線圖

Figure 6. RFQ-PCR melting curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖6Smad3和GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線圖

Figure 7. Expression of Smad3 mRNA in HCC tissues，peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

圖7Smad3mRNA在人、大鼠和樹(shù)鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

Figure 8. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in human HCC tissues (lane 1,3) peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

圖8Westernblotting檢測(cè)Smad3蛋白在人肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

Figure 9. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in rat HCC tissues (lane 1, 3). peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6) GAPDH served as an internal control.

圖9Westernblotting檢測(cè)Smad3蛋白在大鼠肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

Figure 10. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in tree shrew HCC tissues (lane 1,3).peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

圖10Westernblotting檢測(cè)Smad3蛋白在樹(shù)鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

Figure 11. Expression of Smad3 protein in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

圖11Smad3蛋白在人、大鼠和樹(shù)鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達(dá)

討 論

近年提出的跨種屬腫瘤基因組學(xué)策略(cross-species oncogenomics approach)被認(rèn)為是鑒定腫瘤基因的有力工具之一[8]。Colak等[9]通過(guò)基因芯片對(duì)人和大鼠早期肝癌進(jìn)行分析，篩選出包括Smad3等在內(nèi)的數(shù)個(gè)跨種屬保守基因，認(rèn)為其與早期肝癌的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，但未做進(jìn)一步驗(yàn)證。我們也在前期研究中應(yīng)用生物信息學(xué)等技術(shù)，跨種屬地篩選出Smad3等一組肝癌差異表達(dá)基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證Smad3在多個(gè)種屬的肝癌發(fā)生發(fā)展中表達(dá)水平的改變及研究其意義，本研究對(duì)人、大鼠、樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌、癌旁肝組織及正常肝組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting方法分別檢測(cè)Smad3 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上，3個(gè)種屬肝癌組織的Smad3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于同一個(gè)體的癌旁肝組織；但將各種屬的正常肝組織與肝癌、癌旁組織作比較，結(jié)果各不相同——我們推測(cè)此現(xiàn)象可能與種屬特異性相關(guān)。在翻譯水平上，3個(gè)種屬肝癌Smad3蛋白表達(dá)水平均低于癌旁組織和正常肝組織，但樹(shù)鼩各組蛋白水平相比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與所用例數(shù)較少有關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)Smad3轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平并非完全一致，其原因可能為：mRNA翻譯為蛋白的過(guò)程中可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等情況，導(dǎo)致兩者表達(dá)水平不一致。蛋白作為基因功能的執(zhí)行者，在生物功能中起著主要作用，且蛋白表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，因此我們認(rèn)為Smad3蛋白在3個(gè)種屬的肝癌中相對(duì)于癌旁和正常肝組織均呈現(xiàn)低表達(dá)，提示Smad3基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵分子的作用。

TGF-β通路作為人類疾病過(guò)程中最常發(fā)生改變的信號(hào)通路之一，與包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。Smads蛋白是目前所知最重要的細(xì)胞內(nèi)TGF-β受體激酶底物, 可將TGF-β 信號(hào)直接由細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核。研究表明，TGF-β通路的生物學(xué)功能主要通過(guò)其下游的信號(hào)分子Smads進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。Smad3作為Smads家族重要成員之一，在TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中均起著至關(guān)重要的作用[4]。而在參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，Smad3突變極為少見(jiàn)，主要表現(xiàn)為表達(dá)水平的改變[12]。目前已有大量研究證實(shí)Smad3在食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)[13-14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Smad3在人、大鼠和樹(shù)鼩多種屬的肝癌中呈低表達(dá)，提示Smad3表達(dá)水平降低或缺失可能與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，TGF-β通路的抑癌作用已被廣泛認(rèn)可，Smad3作為TGF-β信號(hào)通路的下游介質(zhì)，它的丟失將可能導(dǎo)致TGF-β信號(hào)通路抑癌作用減弱或消失。近年研究發(fā)現(xiàn)，Smad3過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。因此，Smad3常被看作抑癌基因參與腫瘤調(diào)控。目前Smad3與肝癌關(guān)系的研究較少，其具體抑癌機(jī)制尚不明確。Yang等[15]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Smad3能降低肝臟對(duì)化學(xué)誘癌的敏感性，同時(shí)可抑制Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡；他們還發(fā)現(xiàn)Smad3高表達(dá)對(duì)正常肝組織功能無(wú)影響，但在腫瘤形成之初高表達(dá)的Smad3即開(kāi)始發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，認(rèn)為Smad3在肝癌治療方面擁有廣闊的前景。此外，Kim等[16]通過(guò)免疫組化對(duì)肝癌病人Smad3水平進(jìn)行了檢測(cè), 其生存率分析結(jié)果表明，Smad3在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)陽(yáng)性者，其無(wú)復(fù)發(fā)存活率和疾病相關(guān)存活率均較低，而其在細(xì)胞核中的表達(dá)與生存率無(wú)關(guān)，認(rèn)為Smad3可作為判斷肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)志物，對(duì)術(shù)后治療有重要的指導(dǎo)意義。

總之，本研究驗(yàn)證了經(jīng)跨種屬策略篩選出的Smad3在人、大鼠和樹(shù)鼩3個(gè)種屬的肝癌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下調(diào)，這一結(jié)果一方面提示Smad3與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能為肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子之一，另一方面還提示 Smad3可能發(fā)揮著抑癌基因的作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。同時(shí)，本研究結(jié)果也證實(shí)了跨種屬研究腫瘤相關(guān)基因的可行性。下一步，我們將通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Smad3對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為及肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程的影響，其中包括：(1)通過(guò)肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)觀察Smad3過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)行為的影響，并應(yīng)用Western blotting及RT-PCR等技術(shù)進(jìn)一步明確Smad3與主要周期、凋亡相關(guān)基因的關(guān)系；(2)通過(guò)裸鼠人肝癌移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察Smad3過(guò)表達(dá)對(duì)移植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，從而深入探討Smad3作為防治肝癌靶點(diǎn)的可能性。

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Cross-speciescomparisonofSmad3expressioninhepatocellularcarcinomatissues

ZHU Ling-qun1, 2, CAO Ji1, LU Xiao-xu1,2, LI Yuan1, OU Chao1, SU Jian-jia1, YANG Chun1

(1ResearchDepartmentofGuangxiCancerInstitute,2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:cxl_yang@yahoo.com.cn)

AIM: To study the expression of Smad3 and its significance in hepatocellular carcinoma (HCC) in different species including human, rat and tree shrew, and to verify the feasibility of cross-species oncogenomic approach.METHODSReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blotting were applied to detect the expression of Smad3 at mRNA and protein levels in HCC tissues, corresponding HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues collected from different species including human, rat and tree shrew.RESULTSThe mRNA expression of Smad3 in HCC tissues of human, rat and tree shrew was lower than those in the corresponding HCC tissues adjacent liver tissues. The mRNA level of Smad3 in HCC tissues of rat was lower than those in its normal liver tissues, while that in HCC adjacent tissues of tree shrew appeared higher than those in the normal liver tissues. No significant difference of Smad3 expression in other tissues was observed. The protein levels of Smad3 in HCC of human and rat were lower than those in the corresponding HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues. However, the protein expression of Smad3 was at a low level in HCC tissues of tree shrew and was lower than that in the HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues, although without statistical difference. The differences of Smad3 expression between HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues in all the 3 species were not statistically significant.CONCLUSIONSmad3 is lowly expressed in HCC tissues of different species, suggesting that it might play a pivotal role in hepatocarcinogenesis and be applied as a key molecular target in HCC prevention and treatment.

Cross-species; Smad3 protein; Liver neoplasms

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.011

1000- 4718(2013)01- 0070- 06

2012- 08- 28

2012- 11- 21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30960428)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2012GXNSFAA053167)

△通訊作者 Tel:0771-5310593; E-mail: cxl_yang@yahoo.com.cn