胰島素控制血糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織Smad7表達(dá)及纖維化病變的影響*

王圓圓， 李 霜， 劉麗榮， 蘇 博， 石 磊， 石明雋， 肖 瑛， 張國(guó)忠， 郭 兵

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

胰島素控制血糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織Smad7表達(dá)及纖維化病變的影響*

王圓圓， 李 霜， 劉麗榮， 蘇 博， 石 磊， 石明雋， 肖 瑛， 張國(guó)忠， 郭 兵△

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的觀察胰島素控制糖尿病大鼠血糖后是否能上調(diào)腎組織Smad7的表達(dá)，減輕或延緩糖尿病腎病(DN)腎纖維化病變的發(fā)生發(fā)展。方法鏈脲菌素復(fù)制大鼠糖尿病模型，隨機(jī)分為糖尿病組(DM組) 和胰島素治療組(INS組) (n=8)；INS組于成模13周起用胰島素將血糖控制在4～7 mmol/L；同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組(NC組)(n=8)。17周處死大鼠，檢測(cè)相應(yīng)生化指標(biāo)，觀察胰腺和腎組織病理學(xué)改變，免疫組化和Western blotting檢測(cè)各組大鼠腎組織組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)、Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2, Smurf2)、Smad7、 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、層連蛋白(fibronectin, FN)和膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)的蛋白表達(dá)。結(jié)果與NC組比較，DM組大鼠體重顯著減輕，24 h尿蛋白、血糖和甘油三酯顯著升高(P<0.05)，病理檢查顯示胰島被破壞，腎組織TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，并伴有腎小管Smad7和E-cadherin的表達(dá)減少(P<0.05)；而經(jīng)胰島素控制血糖后，INS組大鼠較DM組體重逐漸增加，24 h尿蛋白和血糖均顯著降低 (P<0.05)，腎纖維化病變明顯改善，TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表達(dá)均顯著減少(P< 0.05)，Smad7和E-cadherin的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論控制血糖能恢復(fù)糖尿病大鼠腎組織Smad7蛋白表達(dá)水平，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，延緩DN的纖維化進(jìn)展，其機(jī)制可能與腎組織中TGF-β1和Smurf2表達(dá)降低、Smad7蛋白的泛素化降解減少有關(guān)。

糖尿病腎病； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β； Smad7； 胰島素

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 已成為導(dǎo)致終末期腎衰竭及糖尿病(diabetes mellitus, DM)病死率增加的重要原因。積極防治DN的纖維化病變，對(duì)患者的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。DN的發(fā)病機(jī)制未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1, TGF-β1) / Smads介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路在DN發(fā)病中發(fā)揮著關(guān)鍵的致纖維化效應(yīng)[1-2]。Smad7作為抑制性Smad蛋白，可以抑制TGF-β1/Smads介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，然而在多種腎纖維化疾病過程中，Smad7的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)[1,3]。近年研究表明控制血糖可部分逆轉(zhuǎn)糖尿病腎纖維化病變[4]，但有關(guān)血糖控制與糖尿病大鼠腎損傷的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。本文旨在觀察胰島素控制糖尿病大鼠血糖后是否能減輕或延緩DN腎纖維化病變的發(fā)生發(fā)展，并以Smad7為靶點(diǎn)，探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體重(180±20) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號(hào)為SCXK(京)2009-0004。

1.2主要試劑 鏈脲菌素(streptozotocin, STZ;Sigma)；甘精胰島素(Novo Nordisk);TGF-β1多克隆抗體、β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑(博士德公司);Smad7、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、層連蛋白(fibronectin, FN)和膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司)；Smurf2抗體(Abcam)；兩步法免疫組化檢測(cè)試劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Western印跡用PVDF膜和3 mm Whatman濾紙 (Millipore)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物研究所)。

1.3主要器材 穩(wěn)步倍加型血糖儀(強(qiáng)生公司)，超低溫冰箱(Sanyo)，高速低溫離心機(jī)(Beckman)，Bayer 1650全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)，電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置(Amersham)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

2方法

2.1糖尿病模型的制備和分組 16只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，乙醚麻醉后尾靜脈按55 mg/kg注射0.01 mol/L無(wú)菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的STZ。48 h后測(cè)空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型成功。隨機(jī)分成糖尿病組(DM組)和胰島素治療組(INS組), 每組8只動(dòng)物，INS組從第13周起開始皮下注射甘精胰島素，實(shí)行個(gè)體化劑量，以血糖控制在4～7 mmol/L、尿糖陰性為準(zhǔn)；DM組同時(shí)注射溶媒。并設(shè)相同鼠齡正常對(duì)照組(NC組)(n=8)，操作同上。各組大鼠均給予普通飼料，自由飲水。

2.2大鼠的血、尿、胰腺和腎組織收集 實(shí)驗(yàn)17周時(shí)處死動(dòng)物。處死前收集24 h尿液，記錄尿量。禁食6～8 h，稱重，麻醉后股動(dòng)脈穿刺采集血液，4 ℃離心，分離血清，尿液和血清于-20 ℃保存供檢測(cè)尿蛋白及生化指標(biāo)用。開腹取胰腺和腎臟，胰腺及一側(cè)腎臟固定于4%多聚甲醛供制作石蠟切片用，另一腎臟于-80 ℃保存供Western印跡檢測(cè)。

2.3生化指標(biāo)檢測(cè) 氧化酶法測(cè)血清葡萄糖(blood glucose,BG)； CHOD-PAP法測(cè)血總膽固醇(choleste-rol,CHO)；GOD-PAP法測(cè)血甘油三酯(triglyceride,TG)；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)尿蛋白(urine protein,UP)，均按試劑說(shuō)明書操作。UP與24 h尿量乘積為24 h UP。

2.4胰腺和腎組織形態(tài)學(xué)觀察 胰腺和腎臟組織行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察胰腺和腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，Masson染色觀察腎組織的纖維化病變。

2.5免疫組化染色 采用免疫組化SP法檢測(cè)TGF-β1(1∶50)、Smad7(1∶200)、E-cadherin(1∶75)、α-SMA (1∶100)和collagenⅠ(1∶100)在各組大鼠腎組織的分布和表達(dá)，PBS作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。TGF-β1、FN和collagenⅠ陽(yáng)性表達(dá)計(jì)數(shù)方法參考本實(shí)驗(yàn)室以前的研究[5]，取10個(gè)高倍(400倍)視野，取均值。

2.6Western blotting檢測(cè) 取-80 ℃保存的各組大鼠腎皮質(zhì)，每組100 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿、離心、取上清，用BCA試劑盒(碧云天)測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，按所測(cè)得濃度計(jì)算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min。經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Smad7、Smurf2、E-cadherin、α-SMA或β-actinⅠ抗，工作濃度分別為1∶200、1∶600、1∶100、1∶150和1∶300，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(濃度均為1∶5 000)室溫孵育1 h，再加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室曝光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片，Quantity One軟件分析各條帶的面積和灰度值，兩者乘積為積分灰度值，每個(gè)樣本重復(fù)操作3 次。同一張膠上Smad7、Smurf2、E-cadherin、α-SMA與相應(yīng)的β-actin條帶所測(cè)積分灰度值的比值，即相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析(方差齊時(shí)，采用SNK-q檢驗(yàn)；不齊時(shí)，采用Games-Howell檢驗(yàn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1大鼠一般情況和相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)

糖尿病大鼠模型復(fù)制成功后，DM組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多尿、多食等現(xiàn)象，較相同鼠齡NC組，DM組大鼠體重顯著減輕(P<0.05)，而INS組給予胰島素控制血糖后，大鼠多飲、多尿、多食現(xiàn)象有所改善，體重逐漸增加，在治療4周(總16周)后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； DM組24 h UP、BG和TG顯著高于NC組(P<0.05)，而與DM組大鼠相比，INS組BG和24 h UP均顯著降低(P<0.05)，如見圖1。

2糖尿病大鼠胰腺組織和腎組織病理學(xué)改變

胰腺HE染色可見NC組大鼠胰島完整，輪廓規(guī)則整齊，胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊，胞漿飽滿，細(xì)胞界限清楚，而DM組胰島內(nèi)形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂，常有細(xì)胞缺失、塌陷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。腎組織HE染色顯示NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，DM組大鼠部分腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell, RTEC)空泡變性，細(xì)胞萎縮和脫落，小管間質(zhì)細(xì)胞增多伴有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，毛細(xì)血管基底膜增厚，INS組病變明顯減輕。腎組織Masson染色顯示NC組腎小球完整，清晰，RTEC飽滿，而DM組腎臟結(jié)構(gòu)排列不清，可見腎小球和腎小管纖維化明顯，INS組病變減輕，見圖2。

Figure 1. Levels of metabolic and renal parameters. A: body weight of rats in each group at each equal time；B: levels of 24 h urine protein(24 h UP), blood glucose(BG), cholesterol(CHO), triglyceride(TG) in each group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖1各組大鼠代謝和腎臟參數(shù)

Figure 2. Histological changes of rat pancreatic (A; HE staining,×200) and renal (B; HE staining and Masson staining, ×200) tissues.

圖2各組大鼠胰腺和腎組織形態(tài)學(xué)變化

3TGF-β1、FN、collagenI、E-cadherin和α-SMA蛋白在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果提示，NC組大鼠腎組織TGF-β1極少表達(dá)， FN和collagenⅠ的陽(yáng)性染色僅少量存在于細(xì)胞間質(zhì)；DM組大鼠腎組織TGF-β1、FN和collagenⅠ的表達(dá)明顯增加，均顯著高于NC組(P<0.05)；而INS組大鼠腎組織TGF-β1、FN和collagenⅠ的表達(dá)較DM組明顯減少(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of TGF-β1, FN and collagenⅠ in renal tissues(immunohistochemical staining,×400). The arrows indicate positive expression.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group,▲P<0.05vsDM group.

圖3TGF-β1、FN和collagenⅠ在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

免疫組化顯示，E-cadherin在大鼠腎組織主要表達(dá)于RTEC。Western blotting檢測(cè)表明，與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)中E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而INS組大鼠E-cadherin蛋白表達(dá)較DM組明顯增多(P<0.05)，見圖4。

α-SMA在正常大鼠的腎皮質(zhì)表達(dá)極少，僅在血管周圍見到陽(yáng)性表達(dá)，而在DM組大鼠RTEC可見到大量陽(yáng)性染色。Western blotting檢測(cè)表明：與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)中α-SMA蛋白的表達(dá)顯著增多(P<0.05)，而INS組大鼠α-SMA表達(dá)較DM組顯著減少(P<0.05)，見圖5。

4Smad7和Smurf2蛋白在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

與NC組相比，DM組大鼠腎皮質(zhì)中Smad7蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，僅為正常時(shí)的48%；INS組大鼠Smad7蛋白表達(dá)較DM組明顯增多(P<0.05)，見圖6。

Smurf2在DM組大鼠腎組織表達(dá)增加，顯著高于NC組(P<0.05)，而INS組大鼠腎組織Smurf2表達(dá)較DM組明顯減少(P<0.05)，見圖7。

討 論

本研究用STZ尾靜脈注射復(fù)制大鼠DM模型，DM大鼠血糖顯著升高且尿糖陽(yáng)性，胰腺組織切片可見胰島縮小，β細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)出現(xiàn)明顯的蛋白尿，血肌酐顯著升高，腎組織中FN和collagenⅠ蛋白表達(dá)增多，提示糖尿病大鼠出現(xiàn)腎纖維化的病理改變，并發(fā)有DN。

Figure 4. The level of E-cadherin expression in rat renal tissues. A: Immunohistochemical staining(×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖4E-cadherin在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

Figure 5. The level of α-SMA expression in rat renal tissues. A: immunohistochemical staining (×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖5α-SMA在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

Figure 6. The level of Smad7 expression in rat renal tissues. A: immunohistochemical staining (×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖6Smad7在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

Figure 7. The level of Smurf2 expression in rat renal tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖7Smurf2在各組大鼠腎組織中的表達(dá)

大量研究表明，TGF-β1在嚴(yán)重的腎纖維化病程中表達(dá)均上調(diào)，發(fā)揮多種致纖維化效應(yīng)，成為腎纖維化疾病發(fā)生過程中的重要細(xì)胞因子[1-3]。在DM狀態(tài)下，高糖介導(dǎo)多種細(xì)胞表達(dá)TGF-β1， TGF-β1通過跨膜的Ⅱ型(TβRⅡ)和Ⅰ型(TβRⅠ)受體激活其下游的Smad2/3，Smad2/3隨后與Smad4形成復(fù)合物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中參與TGF-β1目的基因的轉(zhuǎn)錄活化而發(fā)揮其致纖維化效應(yīng)。我們的研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠16周時(shí)，其腎組織中TGF-β1表達(dá)顯著增加，RTEC表達(dá)的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin顯著減少，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA出現(xiàn)高表達(dá)，提示RTEC向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生，且FN和collagenⅠ在腎間質(zhì)也顯著增加，表明細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM) 的沉積增多[2,6-7]。由RTEC經(jīng)EMT過程發(fā)展而來(lái)的成纖維細(xì)胞活化后，可誘導(dǎo)ECM的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重腎臟的纖維化[8]。因此，對(duì)抗TGF-β1的致纖維化效應(yīng)已成為防治腎纖維化的研究熱點(diǎn)。

Smad7蛋白作為抑制性Smad，可通過多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)抗TGF-β1/Smad信號(hào)通路的效應(yīng)：Smad7可與TβRI形成一個(gè)穩(wěn)定復(fù)合物，從而抑制其招募及磷酸化R-Smad及R-Smad-Smad4復(fù)合物的形成[9]，并且與TβRI 結(jié)合的Smad7能作為配體招募WW-HECT型E3泛素連接酶介導(dǎo)對(duì)TβRI的降解[10]，同時(shí)有多種蛋白通過與Smad7結(jié)合而調(diào)節(jié)TβRI的活性和穩(wěn)定性[11]；而在細(xì)胞核內(nèi)，Smad7能通過MH2結(jié)構(gòu)域綁定到特定的DNA結(jié)構(gòu)域，與去乙酰酶抑制劑及其它一些轉(zhuǎn)錄共抑制因子共同抑制TGF-β1/Smad目的基因的轉(zhuǎn)錄[12]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Smad7在腎纖維化疾病進(jìn)程中表現(xiàn)出抑制纖維化病變的作用[1,3]。Liu等[2]將特異性作用于腎臟包含Smad7基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染db/db小鼠后，發(fā)現(xiàn)由TGF-β1/Smad2/3介導(dǎo)的腎纖維化病變明顯減輕[2]；在DN進(jìn)程中，發(fā)現(xiàn)將Smad7基因敲除能增強(qiáng)TGF-β1/Smad2/3介導(dǎo)的腎臟損害，包括：尿蛋白出現(xiàn)、腎小球和腎小管間質(zhì)collagenⅠ、collagenⅣ、FN的沉積，而過表達(dá)Smad7基因能減輕上述病理改變[13]。這些研究提示：Smad7作為TGF-β1/Smad信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其蛋白表達(dá)的水平?jīng)Q定了TGF-β1的生物效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Smad7蛋白在DN時(shí)表達(dá)明顯減少，僅為正常時(shí)的48%，從而使TGF-β1過激活Smad2/3，誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生和ECM的沉積，促進(jìn)DM時(shí)腎組織的纖維化。Fukasawa等[14]的研究結(jié)果顯示，在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型的腎組織中Smad7蛋白的表達(dá)進(jìn)行性減少，但其mRNA的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Smad蛋白的減少是由于E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化降解增強(qiáng)所致，而加入蛋白酶體抑制劑會(huì)抑制Smad7的降解，Liu等[1]也有相同的發(fā)現(xiàn)。但是，也有作者得出不同的研究結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)UUO模型可以導(dǎo)致Smad7 mRNA的表達(dá)減少[15-16]。本實(shí)驗(yàn)的免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)：E3泛素連接酶Smurf2在DN時(shí)的表達(dá)顯著增多，提示DN時(shí)表達(dá)上調(diào)的Smurf2可能增強(qiáng)了對(duì)Smad7蛋白的降解作用，導(dǎo)致Smad7蛋白表達(dá)明顯減少，進(jìn)而使TGF-β1/Smad信號(hào)通路失去控制，促進(jìn)了DN的發(fā)生發(fā)展。但是，Smad7蛋白在DN的表達(dá)減少是由于E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素蛋白酶途徑對(duì)其蛋白的降解作用，還是同時(shí)有mRNA表達(dá)下調(diào)兩者共同作用的結(jié)果，目前并不清楚，將有待于我們進(jìn)一步研究。

我們于DM成模12周后，開始胰島素干預(yù)，通過對(duì)大鼠個(gè)體化治療將其血糖降至正常范圍，觀察控制血糖是否能減緩DN的發(fā)生發(fā)展。隨著胰島素治療時(shí)間的延長(zhǎng)，與DM組大鼠相比，INS組大鼠多飲、多尿、多食現(xiàn)象有所改善，體重逐漸增加、24 h UP顯著降低，TG和CHO表現(xiàn)出減少的趨勢(shì)，提示大鼠的代謝功能明顯改善，并且腎組織HE和Masson染色顯示，腎臟纖維化病變明顯減輕。同時(shí)，大鼠腎組織中Smad7蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，TGF-β1和Smurf2表達(dá)顯著減少，而RTEC表達(dá)的E-cadherin增加，α-SMA表達(dá)減少，F(xiàn)N 、collagenⅠ在腎間質(zhì)的沉積減少。表明控制血糖可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)DN的發(fā)展，其機(jī)制可能是由于TGF-β1和Smurf2表達(dá)下調(diào)，抑制性調(diào)節(jié)蛋白Smad7表達(dá)水平恢復(fù)等共同作用的結(jié)果。

綜上所述，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和Smurf2表達(dá)增加，上調(diào)的Smurf2可能通過增強(qiáng)對(duì)Smad7蛋白的泛素化降解而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展；控制血糖可通過降低腎組織中TGF-β1及Smurf2的表達(dá)而恢復(fù)Smad7蛋白表達(dá)水平，減少ECM的沉積，延緩DN的纖維化進(jìn)展。但是，Smad7蛋白在DN的表達(dá)減少是由于在蛋白水平的降解增加，還是同時(shí)有其基因水平的表達(dá)下調(diào)的綜合作用，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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EffectofbloodglucosecontrolonexpressionofSmad7andrenalfibrosisindiabeticrats

WANG Yuan-yuan, LI Shuang, LIU Li-rong, SU Bo, SHI Lei, SHI Ming-jun, XIAO Ying, ZHANG Guo-zhong, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:guobingbs@126.com)

AIM: To verify the hypothesis that treatment with insulin to control the blood glucose (BG) may relieve or slow down the development of diabetic nephropathy (DN) in diabetic rats by increasing the expression of Smad7.METHODSThe diabetic rat model was established by tail-vein injection of streptozotocin. Sixteen rats were divided into 2 groups. Eight of these animals in diabetes mellitus (DM) group had no treatment. The remaining eight of them in insulin treatment (INS) group were injected with insulin. After 13 weeks, the rats in INS group were given individual treatment with insulin to let the blood glucose level keep within 4 to 7 mmol/L. Meanwhile, 8 rats were used for normal control (NC group). After 16 weeks, the rats were sacrificed to detect the relevant biochemical parameters, and to observe the histophathological changes of the kidney and pancreas. In addition, immunohistochemical staining and Western blotting were employed to detect the protein expression of transforming growth factor β1(TGF-β1), Smad ubiquitin regulatory factor 2 (Smurf2), Smad7, E-cadherin, α-sooth muscle actin (α-SMA), fibronectin (FN) and collagen I.RESULTSCompared with NC group, the body weight was significantly reduced in DM group, whereas the body weight in INS group increased gradually. Compared with NC group, the levels of 24 h urine protein (24 h UP), BG and triglyceride (TG) were remarkably increased in DM group. Pathological detection on pancreas indicated that the islet was destroyed. The levels of TGF-β1, Smurf2, α-SMA, FN and collagenⅠ in the kidneys were increased in DM group, and the expression of Smad7 and E-cadherin, which were mainly located in renal tubular epithelial cells, was significantly reduced. Compared with DM group, the levels of 24 h UP and BG were significantly reduced in INS group, and the alleviated renal fibrosis was observed under light microscope. In addition, the protein levels of TGF-β1, Smurf2, α-SMA, FN and collagenⅠ in INS group were decreased compared with DM group, and the expression of Smad7 and E-cadherin was increased significantly.CONCLUSIONTarget glucose control with insulin treatment restores the protein expression of Smad7 in the kidney of diabetic rats, reduces the accumulation of extracellular matrix and slows down DN progress. The decrease in TGF-β1and Smurf2 expression, and the attenuation of Smad7 ubiquitination in renal tissues are the crucial parts in this process.

Diabetic nephropathies; Transforming growth factor beta; Smad7; Insulin

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.007

1000- 4718(2013)01- 0043- 07

2012-09-02

2012-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160094)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No.黔省專合字 [2010]40號(hào))

△通訊作者 Tel: 0851-6908348; E-mail: guobingbs@126.com