西洋參莖葉總皂苷通過(guò)抑制過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

王 琛, 劉 蜜, 孫 勝, 宋丹丹, 劉秀華△, 史大卓△

(解放軍總醫(yī)院 1中醫(yī)科, 3病理生理研究室, 北京 100853； 2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 北京100091)

西洋參莖葉總皂苷通過(guò)抑制過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷*

王 琛1,2, 劉 蜜2, 孫 勝3, 宋丹丹3, 劉秀華3△, 史大卓2△

(解放軍總醫(yī)院1中醫(yī)科,3病理生理研究室, 北京 100853；2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院, 北京100091)

目的觀察西洋參莖葉總皂苷(PQS)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷的保護(hù)作用，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的角度探討其可能的分子機(jī)制。方法采用SD大鼠心肌I/R模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組與藥物預(yù)處理組，檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)及血清心肌肌鈣蛋白T(cTnT)含量，以氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思藍(lán)雙染法檢測(cè)心梗面積，采用HE染色和TUNEL法分別評(píng)估心肌病理?yè)p傷和心肌細(xì)胞凋亡程度，Western blotting法檢測(cè)心肌組織凋亡調(diào)節(jié)因子以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果與I/R組相比，PQS+I/R組平均動(dòng)脈壓降低32.0%(P<0.05)，左室±dp/dtmax分別升高64.0%和35.0%(P<0.05)，血清cTnT含量降低53.3%(P<0.05)，壞死面積/缺血面積(AN/AAR)百分比降低65.5%(P<0.05)，心肌細(xì)胞凋亡率降低54.9%(P<0.05)；心肌組織病理?yè)p傷程度減輕；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高110.0%(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低47.8%(P<0.05),鈣網(wǎng)蛋白(CRT)表達(dá)降低43.4%(P<0.05)，C/EBP同源蛋白(CHOP)和剪切后的caspase-12蛋白表達(dá)分別降低38.6%和23.7%(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)QS可顯著減輕大鼠心肌I/R損傷，其機(jī)制與降低I/R誘導(dǎo)的CRT過(guò)表達(dá)，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活，從而抑制過(guò)度ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

西洋參莖葉總皂苷； 缺血/再灌注； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

西洋參莖葉總皂苷(Panaxquinquefoliumsaponins, PQS) 是西洋參莖葉中主要的活性成分。以往實(shí)驗(yàn)研究表明，PQS具有減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心律失常、改善梗死后心室重構(gòu)等作用[1-3]，其機(jī)制可能與增強(qiáng)抗氧化酶活性、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等有關(guān)[4]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum, ER) 是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場(chǎng)所。缺血缺氧、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起ER功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress, ERS),表現(xiàn)為ERS標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)和鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin, CRT) 的表達(dá)。持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可誘導(dǎo)ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑如CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP) 和caspase-12的激活,加重I/R損傷[5-6]。我們前期研究表明PQS可通過(guò)抑制ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡而減輕離體培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[7]。PQS對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注模型是否具有相同的作用，其機(jī)制是否與抑制過(guò)度ERS有關(guān)，尚缺少研究。因此本研究旨在證明PQS是否通過(guò)抑制過(guò)度ERS而減輕大鼠心肌I/R損傷。

材 料 和 方 法

1藥品和試劑

PQS粉由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；TUNEL試劑盒購(gòu)自Promaga；氯化三苯基四氮唑 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)和伊文思藍(lán)均購(gòu)自Sigma；蛋白電泳分子量為7～175 kD，為Bio-Rad產(chǎn)品；兔抗人CRT、caspase-12和GRP78多克隆抗體均購(gòu)自Stressgen；兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體、兔抗人Bax和Bcl-2多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signal；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 (ECL) 試劑盒購(gòu)自Millipore；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自Santa Cruz。

2動(dòng)物模型建立

清潔級(jí)健康SD大鼠，雌雄各半，體重(150±20)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)為SCXK-(軍)2007-004]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。術(shù)前禁食12 h，自由飲水，以2%戊巴比妥鈉 (2.3 mL/kg) 腹腔注射麻醉后固定于鼠臺(tái)，氣管插管，采用微型動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)) 支持呼吸，頻率50～60 min-1，潮氣量4～6 mL。連接SMUP-PC1型生物信號(hào)處理系統(tǒng)，以MFL Lab200心電軟件(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室研制)記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖。按照既往報(bào)道方法[8]復(fù)制心肌I/R模型：胸骨正中切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，在胸骨左緣3、4 肋間開(kāi)胸暴露心臟。打開(kāi)心包膜，揭開(kāi)脂肪墊，暴露左心耳后，持7號(hào)針線，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary, LAD) 處穿一縫合線，將充水(0.5 mL) 的球囊墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎造成心肌缺血。心電圖監(jiān)測(cè)顯示進(jìn)行性心肌缺血變化后證明造模成功，45 min后，抽出球囊，關(guān)胸，再灌注24 h。結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)，動(dòng)脈取血，用于血清肌鈣蛋白(cardiac troponin,cTnT)測(cè)定，按照不同檢測(cè)指標(biāo)分別留取心肌組織標(biāo)本迅速液氮冷凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于制備組織切片或進(jìn)行心肌梗死面積測(cè)定。

3實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)分為3組，每組15只。(1)假手術(shù) (sham) 組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開(kāi)胸后穿線，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；(2)I/R組：與藥物組等量飲用水灌胃，每天1次，連續(xù)6周，開(kāi)胸后可逆性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支致心肌缺血45 min，再灌注24 h；(3)藥物預(yù)處理(PQS+I/R)組：(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)270 mg·kg-1·d-1PQS水溶液灌胃，每天1次，連續(xù)6周后進(jìn)行與I/R組相同的干預(yù)。

4觀察指標(biāo)

4.1心率(heart rate,HR)、平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure,MAP)和左室壓上升、下降最大速率(±dp/dtmax)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠稱重，2%戊巴比妥腹腔麻醉，固定后分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，將PE-50 導(dǎo)管插入頸總動(dòng)脈經(jīng)壓力傳感器與SMUP-PC1型生物信號(hào)處理系統(tǒng)相連。穩(wěn)定10 min后，描計(jì)頸動(dòng)脈波形,再將導(dǎo)管送入左室，描計(jì)左心室壓力曲線。以MFL Lab200心功能軟件記錄HR、MAP和±dp/dtmax。

4.2血清cTnT含量測(cè)定 經(jīng)動(dòng)脈插管抽取血液約5 mL，肝素抗凝，1 000 r/min離心10 min，收集血清，液氮速凍，-80 ℃保存。以全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)測(cè)定血清心肌損傷標(biāo)志物cTnT的含量。

4.3心梗面積測(cè)定 按照文獻(xiàn)[9]報(bào)道方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后原位結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌注1%伊文思藍(lán)2 mL，將非缺血區(qū)藍(lán)染，顯示出缺血區(qū)心肌。取出心臟，去除左右心房，置于-20 ℃冷凍20 min，垂直其長(zhǎng)軸橫切為5片厚約2 mm的心肌片，按順序置人2% TTC磷酸緩沖液中，避光37 ℃孵育10 min，此時(shí)梗死區(qū)為灰白色，即壞死面積(area of necrosis，AN)；缺血非梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)面積(area at risk，AAR)為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)之和，正常區(qū)為藍(lán)色。掃描儀掃描成像，以Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4．1) 分別計(jì)算各部分面積，缺血心肌用AAR與左心室(left ventricle，LV)面積之比表示，梗死范圍以AN與AAR之比表示。

4.4心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 經(jīng)頸動(dòng)脈取血后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，4%甲醛固定1周，常規(guī)石蠟包埋，制備3 μm切片。采用TUNEL法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。共聚焦顯微鏡觀察，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的綠色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比(%)，以凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)表示。

4.5心肌病理學(xué)觀察 采用HE染色，將心肌組織樣本固定于4% 甲醛1周后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度3 μm，脫蠟至水，Harris蘇木素染核，70%鹽酸乙醇分化，1%乙醇伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，光鏡觀察并攝像。

4.6Western blotting分析 按文獻(xiàn)報(bào)道方法[10]，提取心肌組織總蛋白，Bradford法蛋白定量后，-80 ℃保存。取上述蛋白提取液上清 (含蛋白150 μg) 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)。將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 (nitrocellulose, NC)膜。5% BSA封閉40 min后分別加入Bcl-2、Bax、CRT、GRP78和caspase-12多克隆抗體(均為1∶500)和CHOP單克隆抗體 (1∶500) 4 ℃過(guò)夜孵育，1× TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH (1∶500) 單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，作為上樣對(duì)照。化學(xué)發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus (Version 4.1) 軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值 (integrated absorbance，IA=A×面積)，以靶蛋白IA值/GAPDHIA值的比值反映靶蛋白水平。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進(jìn)行多組間比較，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PQS對(duì)大鼠心肌I/R損傷的影響

1.1平均動(dòng)脈壓和左室壓上升、下降最大速率 術(shù)中假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，I/R組和PQS+I/R組分別死亡大鼠3只和4只，死亡原因包括感染、嚴(yán)重心律失?；蚵樽碇滤馈８鹘M大鼠心率無(wú)顯著差異 (P>0.05)；與sham組比較，I/R組MAP 高55% (P<0.05)，左室(±dp/dtmax)分別低42%和43% (P<0.05)。PQS干預(yù)后可明顯改善I/R大鼠心功能，表現(xiàn)為PQS+I/R組MAP較I/R組低32% (P<0.05)，±dp/dtmax分別較I/R組高64%和35% (P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 PQS對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinquefoliumsaponins.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

1.2PQS對(duì)血清cTnT含量的影響 I/R組血清cTnT含量較sham組顯著升高，為sham組的3.9倍(P<0.05)，PQS干預(yù)可明顯減少I/R大鼠血清cTnT的含量，PQS+I/R組血清cTnT含量較I/R組低53.3% (P<0.05),見(jiàn)圖1。

1.3PQS對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響 伊文思藍(lán)和TTC雙染評(píng)價(jià)心梗面積，結(jié)果顯示,sham組大鼠無(wú)心肌梗死，sham組、I/R組和PQS+I/R組的缺血區(qū)面積分別為(49.8 ±3.4)%、(50.2±2.2)% 和(50.1±1.3)%，各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；I/R組AN/AAR百分比為(44.2±1.4)%，PQS明顯縮小心梗面積，PQS+I/R組AN/AAR百分比為(15.3±4.2)%，較I/R組降低65.5%(P<0.05),見(jiàn)圖2。

Figure 1. Effect of PQS on content of cTnT in serum.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖1PQS對(duì)血清cTnT含量的影響

Figure 2. Effect of PQS on myocardial infarct size in rats.I/R: ischemia/reperfusion; PQS:Panaxquinqueliumsaponins.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsI/R.

圖2PQS對(duì)心肌梗死面積的影響

1.4PQS對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 Sham組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(8.2±0.6)%，I/R可致心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，I/R組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(56.9±6.0)%，是sham組的7.0倍(P<0.05)，PQS可顯著減輕I/R所致的心肌細(xì)胞凋亡，PQS+I/R組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(25.7±5.1)%，較I/R組低54.9% (P<0.05),見(jiàn)圖3。

1.5心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 光鏡檢查結(jié)果顯示，sham組心肌組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變，肌纖維完整，排列規(guī)則；I/R組心肌纖維排列不規(guī)則，結(jié)構(gòu)紊亂，局部橫紋消失，呈斷裂、壞死融合；PQS+I/R組病理變化程度較I/R組減輕，未見(jiàn)明顯的心肌纖維斷裂、溶解、壞死,見(jiàn)圖4。

1.6凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示,與sham組比較，I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)低54.9%(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)是sham組的3.9倍(P<0.05)。PQS可顯著誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，PQS+I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)是I/R組的2.1倍 (P<0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax蛋白表達(dá)較I/R組低47.8% (P<0.05),見(jiàn)圖5。

2PQS對(duì)I/R心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

2.1GRP78和CRT蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示,I/R可明顯誘導(dǎo)GRP78和CRT蛋白的表達(dá)，與sham組比較，I/R組GRP78、CRT蛋白表達(dá)水平顯著增加，分別為sham組的3.1倍和3.0倍(P<0.05)；PQS可抑制I/R誘導(dǎo)的CRT過(guò)表達(dá)，較I/R組低43.4% (P<0.05),見(jiàn)圖6。

2.2CHOP蛋白表達(dá)的變化和caspase-12的活化 I/R可明顯誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)，為sham組的3.4倍(P<0.05)。PQS抑制I/R誘導(dǎo)的CHOP 蛋白表達(dá)，較I/R組降低38.6% (P<0.05),見(jiàn)圖7。

采用可同時(shí)識(shí)別caspase-12酶原 (pro-caspase-12，分子量約48～50 kD) 和剪切后的caspase-12 (cleaved caspase-12，分子量為36 kD) 的特異性抗體，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示,I/R可明顯誘導(dǎo)caspase-12蛋白剪切活化，剪切后的caspase-12的蛋白表達(dá)是sham組的2.5倍(P<0.05)；PQS抑制I/R后caspase-12 蛋白活化，PQS+I/R組剪切后caspase-12蛋白表達(dá)較I/R組降低23.7% (P<0.05),見(jiàn)圖7。

討 論

冠脈結(jié)扎法建立大鼠心肌I/R損傷模型，為目前評(píng)價(jià)藥物心肌缺血保護(hù)最常用的模型之一。因?qū)嶒?yàn)大鼠品系純正、組間差異小、冠脈側(cè)枝循環(huán)少、易結(jié)扎、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，成為首選I/R動(dòng)物模型。本研究采用SD大鼠， 建立I/R損傷模型，肉眼觀察可見(jiàn)模型組左室前壁心肌顏色變淡甚至蒼白，而假手術(shù)組無(wú)明顯改變。心肌組織病理學(xué)染色與心梗面積測(cè)定既是反映組織損傷最直觀的指標(biāo)，亦是反映藥物治療缺血性損傷有效性的客觀證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用心肌組織病理HE染色觀察心肌組織病理變化，結(jié)果顯示模型組細(xì)胞核固縮，間質(zhì)水腫，心肌纖維排列紊亂、斷裂；假手術(shù)組未見(jiàn)明顯改變； PQS組心肌組織病理變化程度較I/R組減輕。采用伊文思藍(lán)、TTC雙染評(píng)價(jià)心梗面積，結(jié)果顯示各組缺血區(qū)無(wú)顯著差異，說(shuō)明各組結(jié)扎部位一致，不存在因結(jié)扎部位的不同而造成的人為誤差；模型組心梗面積較假手術(shù)組明顯增加，PQS可顯著減少I/R導(dǎo)致的心梗面積；平均動(dòng)脈壓是一個(gè)心動(dòng)周期中持續(xù)地推動(dòng)血液向前流動(dòng)的平均推動(dòng)力，更精確地反映心臟和血管的機(jī)能狀態(tài)，每一心動(dòng)周期由于舒張期時(shí)程長(zhǎng)于收縮期，故平均動(dòng)脈壓不是收縮壓與舒張壓的平均數(shù)，而是更靠近于舒張壓，平均動(dòng)脈壓升高說(shuō)明血管壁彈性減少，順應(yīng)性下降。本研究發(fā)現(xiàn)模型組平均動(dòng)脈壓較假手術(shù)組明顯升高，反映左室舒張及收縮功能的±dp/dtmax顯著降低， PQS能顯著降低I/R引起的平均動(dòng)脈壓升高，增加左室±dp/dtmax；心肌損傷標(biāo)志物cTnT是目前診斷心肌損傷的特異性標(biāo)志物，心肌急性缺血(氧)時(shí)，細(xì)胞膜損傷，通透性增加，cTnT大量漏出。本研究發(fā)現(xiàn)缺血45 min、再灌注24 h后，血清cTnT含量明顯增加。與模型組相比，PQS組血清nTnT顯著減少。以上均提示PQS可保護(hù)I/R心肌損傷，表現(xiàn)為減輕心肌壞死、改善心功能、減輕心肌細(xì)胞膜損傷等。

Figure 3. Effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index.Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

圖3PQS對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

Figure 4. Morphological changes of rat myocardial tissues (×200). A:sham group; B:ischemia/reperfusion group; C: pretreatment withPanaxquinqueliumsaponins group.

圖4大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

Figure 5.Panaxquinquefoliumsaponins (PQS) reduced the expression of pro-apoptotic protein Bax and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖5PQS對(duì)I/R心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of GRP78 and CRT in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖6PQS對(duì)I/R心肌GRP78和CRT蛋白表達(dá)的影響

Figure 7. Effect ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) on the expression of the ERS-associated apoptotic protein CHOP and activation of the apoptotic effector enzyme caspase-12 in I/R myocardium.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsI/R.

圖7PQS對(duì)I/R心肌CHOP蛋白表達(dá)及caspase-12活化的影響

細(xì)胞凋亡是心肌I/R損傷的一個(gè)重要特征，在心肌I/R損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。Gottlieb等[12]利用家兔離體心臟灌流模型首次發(fā)現(xiàn)I/R中存在心肌細(xì)胞凋亡。Musat-Marcu等[13]研究發(fā)現(xiàn)離體灌流大鼠心臟再灌注早期即可發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL法測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，既可定性又可定量，可準(zhǔn)確定位，且靈敏度高。本研究利用此方法發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，PQS可顯著降低I/R引起的細(xì)胞凋亡，提示PQS可通過(guò)抑制I/R心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌I/R損傷。抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax參與心肌I/R損傷細(xì)胞凋亡的調(diào)控[14-16]，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，是促進(jìn)心肌I/R損傷后心功能恢復(fù)和減輕心肌致死性損傷的一條重要途徑。本研究采用Western blotting，檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)模型組促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高，抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)明顯降低，PQS可明顯降低I/R誘導(dǎo)的Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)。提示PQS可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程，減輕心肌損傷。

I/R發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)是氧自由基產(chǎn)生和鈣超載。ER是調(diào)節(jié)Ca2+和蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，ER理化環(huán)境改變和ER過(guò)負(fù)荷等因素導(dǎo)致的ERS在I/R損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義[17]。GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子，早期ERS時(shí)GRP78與ER內(nèi)誤折疊及未折疊蛋白結(jié)合，減輕ER負(fù)荷，恢復(fù)其穩(wěn)態(tài)。因此，GRP78的表達(dá)標(biāo)志ERS的發(fā)生。Shibata等[18]發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦缺血1 h后GRP78表達(dá)升高；Flores-Diaz等[19]報(bào)道，心肌缺血/缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、CRT表達(dá)上調(diào)。本研究采用Western blotting方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)各處理組GRP78的蛋白表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，提示I/R誘發(fā)了ERS，與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致。PQS通過(guò)調(diào)節(jié)ERS，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而增加心肌抗I/R損傷的能力；CRT是ER中主要鈣結(jié)合伴侶蛋白，在維持細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)，協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。Ihara等[21]利用H9c2成心肌細(xì)胞研究證實(shí)高表達(dá)的CRT可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究亦發(fā)現(xiàn)I/R誘導(dǎo)CRT蛋白表達(dá)水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。PQS可減輕I/R誘導(dǎo)的CRT過(guò)表達(dá)，表明PQS可通過(guò)調(diào)節(jié)CRT蛋白表達(dá)，減少I/R引起的細(xì)胞凋亡。

I/R誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，除經(jīng)典的死亡受體途徑和線粒體途徑外，ERS相關(guān)凋亡途徑引起廣泛關(guān)注[23-26]。持續(xù)或嚴(yán)重的ERS通過(guò)激活凋亡信號(hào)分子 CHOP、caspase-12和JNK啟動(dòng)ERS相關(guān)凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CHOP又稱生長(zhǎng)停滯及DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153, GADD153)，是CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，為ERS相關(guān)凋亡途徑的特異性標(biāo)志物。嚴(yán)重ERS時(shí)，CHOP通過(guò)直接調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因，增加細(xì)胞對(duì)ERS介導(dǎo)凋亡的敏感性[27]。研究表明，缺血/缺氧可誘導(dǎo)CHOP表達(dá)顯著增加，破壞了Bcl-2家族促凋亡與抗凋亡基因之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，I/R顯著誘導(dǎo)了CHOP蛋白表達(dá)，PQS可顯著抑制I/R誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)，提示PQS可能通過(guò)抑制過(guò)度ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到心肌保護(hù)作用。Caspase-12定位于ER外膜，以無(wú)活性的酶原形式存在，是ERS相關(guān)凋亡途徑的特異性分子，持續(xù)或嚴(yán)重的ERS引起caspase-12激活，活化的caspase-12進(jìn)一步激活casepase-9，接著激活caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R可明顯誘導(dǎo)剪切后caspase-12的蛋白表達(dá)，提示ERS相關(guān)凋亡途徑在I/R損傷中具有重要作用，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致。PQS可顯著抑制I/R誘導(dǎo)的caspase-12活化， PQS抑制I/R引起的細(xì)胞凋亡也與其抑制caspase-12活化有關(guān)。

綜上所述，PQS具有抗大鼠心肌I/R損傷的作用，其機(jī)制可能通過(guò)抑制過(guò)度ERS引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)，表現(xiàn)為降低I/R誘導(dǎo)的CRT過(guò)表達(dá)，抑制CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路激活，其下游信號(hào)通路有待進(jìn)一步探索。

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Panaxquinquefoliumsaponinsprotectratmyocardiumfromischemia/reperfusioninjurythroughattenuatingexcessiveendoplasmicreticulumstress

WANG Chen1,2, LIU Mi2, SUN Sheng3, SONG Dan-dan3, LIU Xiu-hua3, SHI Da-zhuo2

(1DepartmentofTraditionalChineseMedicine,3DepartmentofPathophysiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;2XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China.E-mail:xiuhualiu98@yahoo.com.cn;shidz666@sohu.com)

AIM: To investigate whether excessive endoplasmic reticulum stress (ERS) is involved in the protective mechanism ofPanaxquinquefoliumsaponins (PQS) against ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat myocardium.METHODSThe model of myocardial I/R injuryinvivowas made by ligating the left anterior descending artery for 45 min followed by 24 h of reperfusion in SD rats. The hemodynamics and serum content of cardiac troponin T (cTnT) were measured. The myocardial infarct size was measured by Evans blue and 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Cardiomyocyte apoptosis was detected usinginsituTDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The protein levels of glucose-regulated protein 78 (GRP78), calreticulin (CRT), C/EBP homologous protein (CHOP), caspase-12, apoptosis-associated proteins Bax and Bcl-2 were determined by Western blotting.RESULTSCompared with I/R group, the mean arterial pressure in PQR+IR group was decreased by 32.0%, and left ventricular±dp/dtmaxwas increased by 64.0% and 35.0%， respectively.The serum content of cTnT was decreased by 53.3%, the percentage of area of necrosis (AN)/area at risk (AAR) was reduced by 65.5% and the apoptosis rate was decreased by 54.9%.The myocardial pathological changes were improved. Bcl-2 protein expression was increased by 110.0% and that of Bax was decreased by 47.8%. CRT protein expression was decreased by 43.4 %, CHOP protein expression and the protein level of cleaved caspase-12 were decreased by 38.6% and 23.7% in PQS+I/R group.CONCLUSIONPQS alleviates I/R injury in myocardium by inhibition of excessive ERS.

Panaxquinquefoliumsaponins; Ischemia/reperfusion; Endoplasmic reticulum stress

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.004

1000- 4718(2013)01- 0020- 08

2012- 08- 20

2012- 11- 21

科學(xué)技術(shù)部國(guó)際科技合作項(xiàng)目資助課題(No.2010DFA31690)

△通訊作者 劉秀華 Tel：010-66939774； E-mail: xiuhualiu98@yahoo.com.cn； 史大卓 Tel： 010-62860499； E-mail: shidz666@sohu.com