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    軟脈降脂合劑干預(yù)動(dòng)脈搭橋術(shù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究*

    2013-10-25 00:47:42賀嵩敏李秀麗黃小千張小寧鄭廣娟
    中國病理生理雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:搭橋術(shù)降脂合劑

    許 平, 彭 輝, 朱 瑩, 賀嵩敏, 馮 兵, 李秀麗, 黃小千, 陳 婷, 張小寧, 鄭廣娟△

    (1廣東省心血管病研究所, 2廣東省人民醫(yī)院,廣東 廣州 510080; 3 廣東省中醫(yī)院, 4廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院,廣東 廣州 510006;5山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355; 6廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006; 7安徽省立友誼醫(yī)院,安徽 合肥 230041)

    軟脈降脂合劑干預(yù)動(dòng)脈搭橋術(shù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究*

    許 平1,2, 彭 輝3,4, 朱 瑩3,4, 賀嵩敏3,4, 馮 兵3,4, 李秀麗5, 黃小千5, 陳 婷6, 張小寧7, 鄭廣娟3,4△

    (1廣東省心血管病研究所,2廣東省人民醫(yī)院,廣東 廣州 510080;3廣東省中醫(yī)院,4廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院,廣東 廣州 510006;5山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;6廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510006;7安徽省立友誼醫(yī)院,安徽 合肥 230041)

    目的觀察軟脈降脂合劑對(duì)兔動(dòng)脈搭橋術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響,探討軟脈降脂合劑在動(dòng)脈搭橋術(shù)后再狹窄發(fā)生過程中的防治作用,以及中藥治療冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)后再狹窄的可能作用機(jī)制。方法新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組:模型組、阿司匹林對(duì)照組、軟脈降脂中劑量組和軟脈降脂高劑量組,行右側(cè)頸動(dòng)脈搭橋術(shù)。術(shù)后給藥灌胃8周后,取抗凝血用流式細(xì)胞儀檢測循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CECs),取血清用ELISA檢測P-選擇素和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)水平。結(jié)果各給藥組和模型組比較,CECs相對(duì)比例、P-選擇素和ICAM-1明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。軟脈降脂合劑2組與阿司匹林對(duì)照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論中藥軟脈降脂合劑能夠降低動(dòng)脈搭橋術(shù)后的CECs、P-選擇素和ICAM-1水平,有助于改善CABG術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

    軟脈降脂合劑; 動(dòng)脈搭橋術(shù); 內(nèi)皮細(xì)胞

    動(dòng)脈粥樣硬化是當(dāng)今世界威脅人類健康、導(dǎo)致人群發(fā)病和死亡的主要疾病之一。冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(coronary artery bypass grafting,CABG)是晚期冠心病患者主要的治療方法。術(shù)后10年,約有50%靜脈橋血管出現(xiàn)嚴(yán)重狹窄[1],而內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是靜脈橋病變的始動(dòng)因素和主要原因[2]。本研究旨在觀察中藥復(fù)方軟脈降脂合劑對(duì)兔動(dòng)脈搭橋術(shù)后內(nèi)皮功能的影響,從而為CABG預(yù)后的改善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1材料

    1.1試劑和儀器 FITC標(biāo)記CD146抗體(eBioscience);小鼠抗兔CD45抗體(AbD Serotec MCA808GA);PE標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz);兔可溶性P-選擇素(soluble P-selectin,sP-selectin) 酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Cusabio);兔細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1/CD54)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Cusabio)。軟脈降脂合劑,由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥廠提供,產(chǎn)品批號(hào):20l20601;阿司匹林腸溶片購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司,產(chǎn)品批號(hào):BJ06370。Eppendorf高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),型號(hào)為5430R;貝克曼庫爾特公司產(chǎn)流式細(xì)胞儀,型號(hào)為FC500;WPI雙目動(dòng)物手術(shù)顯微鏡,型號(hào)為PSMT5。

    1.2動(dòng)物 新西蘭大白兔32只,雌、雄不限,體重2.0~2.5 kg,由廣州市花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場提供,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)為SYXK(粵)2008-0094,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為0104377。

    2方法

    2.1動(dòng)脈搭橋術(shù)動(dòng)物模型建立 按文獻(xiàn)[3-4]建立動(dòng)物模型。兔稱取體重后,按1 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,給予2 500 U肝素抗凝。外科無菌操作技術(shù)下,取右側(cè)頸靜脈約2 cm作為自體血管橋備用,斷端用8/0號(hào)線縫合。分離暴露右側(cè)頸動(dòng)脈,在手術(shù)顯微鏡下以10/0 prolene線將截取的頸靜脈與該段頸動(dòng)脈行端側(cè)吻合。鏡下觀察吻合端血流通暢,無漏血滲血。遂切口分層縫合,創(chuàng)面滴青霉素?cái)?shù)滴以防感染。術(shù)后常規(guī)給予青霉素肌注3d以預(yù)防感染。手術(shù)后至處死前均給予肝素2 500 U/d。手術(shù)過程中死亡1只,考慮該只動(dòng)物手術(shù)時(shí)間過長,循環(huán)衰竭死亡。

    2.2分組及給藥 32只新西蘭大白兔,隨機(jī)分為4組:模型組、阿司匹林對(duì)照組、軟脈降脂中劑量組、軟脈降脂高劑量組,每組8只。行右側(cè)頸總動(dòng)脈搭橋術(shù)后,各組均飼以正常飲食,模型組給予生理鹽水10 mL/d灌胃,阿司匹林對(duì)照組給予阿司匹林每只2.2 mg/d灌胃,軟脈中、高劑量組分別給予每只0.11 g/d、0.22 g/d灌胃。給藥時(shí)間為8周。灌胃過程中模型組死亡2只,解剖發(fā)現(xiàn)吻合段血管栓塞,且感染嚴(yán)重,考慮術(shù)后并發(fā)癥死亡。

    3指標(biāo)檢測

    3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cells,CECs)比例 以含 EDTA-K2抗凝的血常規(guī)管采血2 mL,血液采集后2 h內(nèi)處理。取2支流式管,其中第1管加入5 μL CD146-FITC,檢測單種CD146標(biāo)記的CECs;第2管先加入5 μL CD146-FITC,然后每管加入EDTA-K2 抗凝的全血50 μL。洗脫后第2管再加入共同孵育過的5 μL CD45和5 μL IgG-PE,檢測2種標(biāo)記的CECs?;靹蚝笫覝叵卤芄夥跤?0 min ,加入10 mL 溶血素,37 ℃水浴箱內(nèi)放置10 min,待完全溶血后,立刻上流式細(xì)胞儀檢測。

    3.2ELISA檢測P-選擇素表達(dá) 分離膠促凝采血管取血,離心后取血清。酶聯(lián)板標(biāo)準(zhǔn)孔中加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,檢測孔分別加入已稀釋血清50 μL,并立即加入酶結(jié)合物工作液50 μL,輕輕晃動(dòng)混勻。37 ℃反應(yīng)30 min。洗板5次,每次浸泡1~2 min,200 μL/well,甩干。依序每孔加底物溶液90 μL,37 ℃避光顯色10 min。依序每孔加終止溶液50 μL,終止反應(yīng)。15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)。用專業(yè)軟件Curve Exert 1.3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式計(jì)算出樣品濃度。

    3.3ELISA檢測ICAM-1表達(dá) 分離膠促凝采血管取血,離心后取血清。酶聯(lián)板空白孔中加樣品稀釋液100 μL,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL,輕輕晃動(dòng)混勻。37 ℃反應(yīng)120 min。棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL,37 ℃,60 min。溫育60 min后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1~2 min,200 μL/well,甩干。依序每孔加底物溶液90 μL,37 ℃避光顯色5 min。依序每孔加終止溶液50 μL,終止反應(yīng)。15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的A值。用專業(yè)軟件Curve Exert 1.3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式計(jì)算出樣品濃度。

    4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組之間比較采用方差分析。

    結(jié) 果

    1CECs檢測結(jié)果

    單標(biāo)CD146+CECs絕對(duì)計(jì)數(shù)及相對(duì)比例分析,各給藥組與模型組比較均減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),軟脈降脂合劑中、高劑量2組與阿司匹林對(duì)照組比較也有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);雙標(biāo)CD146+/CD45-CECs絕對(duì)計(jì)數(shù)及相對(duì)比例分析,各給藥組與模型組比較均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),軟脈降脂合劑高劑量組與阿司匹林對(duì)照組比較也有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);軟脈降脂合劑2組組間未見顯著差異,但是表現(xiàn)出一定的量效正相關(guān),見圖1。

    Figure 1. The comparison of the absolute number and relative proportion of CECs detected by two methods. A: absolute number of CD146+CECs; B: relative proportion of CD146+CECs; C: absolute number of CD146+/CD45-CECs; D: relative proportion of CD146+/CD45-CECs.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

    圖12種方法標(biāo)記CECs的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)比例比較

    2P-選擇素ELISA檢測結(jié)果

    軟脈降脂合劑中、高劑量組和阿司匹林對(duì)照組P-選擇素含量與模型組相比均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),軟脈降脂合劑高劑量組與阿司匹林對(duì)照組比較也有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

    3ICAM-1ELISA檢測結(jié)果

    軟脈降脂合劑中、高劑量組和阿司匹林對(duì)照組ICAM-1水平與模型組相比均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),軟脈降脂合劑中、高劑量組ICAM-1水平與阿司匹林對(duì)照組比較也有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    討 論

    CABG術(shù)后再狹窄是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VECs)損傷是導(dǎo)致術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵因素。CECs是指外周血中測得的血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前的研究表明,CECs數(shù)量可以表明血管損傷的程度或和其相關(guān),而且CECs的決定因素比較單一。外周血中增多的循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞有效反映血管的損傷和機(jī)能障礙。因此,CECs可以作為檢測抗血管損傷治療藥物療效的標(biāo)志物之一,在血管損傷治療中具有很大的研究前景[5]。由于現(xiàn)在對(duì)定義CECs的最好CD分子組合缺乏統(tǒng)一性,并且兔的抗體不易獲得,我們選擇了最被大家廣泛應(yīng)用的CD146和CD45。通過CD45-來排除造血細(xì)胞及活化的T淋巴細(xì)胞。CD146是重要的標(biāo)志物,雖然CD146在滋養(yǎng)母細(xì)胞、骨髓成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞上都有表達(dá),但是它是能從CD45-細(xì)胞群中分辨出CECs的特異性標(biāo)志物。

    Figure 2. Concentration of P-selectin detected by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

    圖2P-選擇素ELISA檢測結(jié)果分析

    Figure 3. Concentration of ICAM-1 measured by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

    圖3ICAM-1ELISA檢測結(jié)果分析

    隨著對(duì)再狹窄分子機(jī)制的深入研究,人們發(fā)現(xiàn)參與再狹窄過程中的多種粘附分子都參與其中。P-選擇素是細(xì)胞粘附分子中的選擇素家族的主要成員之一。血管受損后,P-選擇素暴露于血小板質(zhì)膜表面,通過與單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表面的配體結(jié)合,在血小板和白細(xì)胞相互作用的過程中,啟動(dòng)血栓形成的凝血反應(yīng)[6],并且導(dǎo)致血管內(nèi)膜的增生[7]。從而,在與CABG術(shù)后再狹窄的炎癥反應(yīng)和血栓形成中起重要作用。

    ICAM-1是細(xì)胞表面上的一種跨膜蛋白抗原,在CABG中,不僅造成白細(xì)胞浸潤、活化、炎癥因子釋放,加劇了組織的損傷,而且導(dǎo)致?lián)p傷的組織修復(fù)延滯;同時(shí)位于白細(xì)胞表面的粘附分子——β2整合素,即血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1(CD54)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以進(jìn)一步增強(qiáng)白細(xì)胞的上述變化以及淋巴細(xì)胞的活化。有研究顯示,通心絡(luò)超微粉可能通過抗氧化、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位進(jìn)而降低ICAM-1蛋白表達(dá)保護(hù)血管內(nèi)皮功能,有效阻止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[8]。ICAM-1升高的程度直接反映內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) ICAM-1 的狀況,因此,血漿中的ICAM-1可作為一種潛在內(nèi)皮功能狀態(tài)的標(biāo)志[9]。

    活血化瘀中藥干預(yù)心血管疾病已得到眾多研究肯定,有報(bào)道蜂膠水提物通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[10]。根據(jù)中醫(yī)藥理論及CABG術(shù)后VECs損傷的病理生理機(jī)制的新的觀點(diǎn),我們提出益氣活血降濁軟堅(jiān)中藥配伍有望提高干預(yù)CABG術(shù)后VECs損傷的療效,進(jìn)而提出了益氣活血降濁軟堅(jiān)中藥組方的復(fù)方:軟脈降脂合劑,并且對(duì)其降脂及改善內(nèi)皮功能進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn),包括基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究[11]及臨床研究[12]。軟脈降脂合劑是由黃芪、丹參、決明子及昆布的提取物等組成,其功能主要是益氣健脾、化痰降濁和活血通絡(luò)。

    實(shí)驗(yàn)中我們采用了單標(biāo)CD146+計(jì)數(shù)CECs法及雙標(biāo)CD146+/CD45-計(jì)數(shù)CECs法,比較了實(shí)驗(yàn)兔模型組與給藥組CECs占全血細(xì)胞數(shù)量的百分比情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組和給藥組比較,無論在單標(biāo)CD146計(jì)數(shù)CECs法還是在2種標(biāo)志物計(jì)數(shù)CECs法中,平均CECs的百分比均是明顯增高,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥與西藥對(duì)照組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而軟脈降脂合劑中、高兩個(gè)劑量組雖然組間比較未見有顯著差異,但是還是表現(xiàn)出了一定的量效關(guān)系。ELISA檢測P-選擇素和ICAM-1的表達(dá),軟脈降脂合劑中、高劑量組和西藥對(duì)照組與模型組相比均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),軟脈降脂合劑高劑量組與西藥對(duì)照組比較也有降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究發(fā)現(xiàn),在CABG術(shù)后,P-選擇素和ICAM-1的表達(dá)主要在手術(shù)段血管內(nèi)皮細(xì)胞升高,軟脈降脂合劑能夠明顯抑制損傷血管內(nèi)膜P-選擇素和ICAM-1的表達(dá),同時(shí)降低CECs數(shù)量,從而減輕術(shù)后內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。綜上可見,中藥軟脈降脂合劑對(duì)于CABG術(shù)后的血管內(nèi)皮損傷有促進(jìn)修復(fù)的作用,有助于改善CABG的預(yù)后。

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    EffectofRuanmaijiangzhimixtureinterventiononendothelialcellfunctionafterarterybypassgraft

    XU Ping1,2, PENG Hui3, 4, ZHU Ying3, 4, HE Song-min3, 4, FENG Bing3, 4, LI Xiu-li5, HUANG Xiao-qian5, CHEN Ting6, ZHANG Xiao-ning7, ZHENG Guang-juan3,4

    (1GuangdongCardiovascularInstitute,2GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3GuangdongHospitalofTraditionalChineseMedicine,4GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,Guangzhou510006,China;5ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;6GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China;7AnhuiProvincialFriendshipHospital,Hefei230041,China.E-mail:zhengguangjuan@163.com)

    AIM: To observe the effect of Ruanmaijiangzhi mixture on the function of endothelial cells in rabbits after artery bypass graft.METHODSA New Zealand white rabbit model of right common carotid artery bypass graft was established. The rabbits were randomly divided into 4 groups: model group, aspirin control group, middle dose of Ruanmaijiangzhi group and high dose of Ruanmaijiangzhi group. Eight weeks after treatment, circulating endothelial cells (CECs) in anticoagulated blood were detected by flow cytometry. The serum levels of P-selectin and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) were measured by ELISA.RESULTSCompared with model group, the relative ratio of CECs, and the levels of P-selectin and ICAM-1 in medication administration groups were significantly decreased. The effect in Ruanmaijiangzhi groups was better than that in aspirin control group. Ruanmaijiangzhi treatment showed a positive dose-related correlation.CONCLUSIONChinese medicine Ruanmaijiangzhi mixture decreases CECs, P-selectin and ICAM-1 to improve the endothelial cell function after coronary artery bypass graft.

    Ruanmaijiangzhi mixture; Artery bypass graft; Endothelial cells

    R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.003

    1000- 4718(2013)01- 0015- 05

    2012- 11- 01

    2012- 12- 20

    廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.9151009504000007);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.20104425110005)

    △通訊作者 Tel:020-81887233;E-mail:zhengguangjuan@163.com.

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