STK15過表達對人食管癌細胞株KYSE150生長的影響*

王曉霞， 李曉鐘， 路 娜， 趙 艷， 王 康， 裴 毅

(1山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室, 山西 太原 030001; 2山西省人民醫(yī)院急診科,山西 太原 030012; 3山西醫(yī)學科學院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科, 山西 太原 030032)

STK15過表達對人食管癌細胞株KYSE150生長的影響*

王曉霞1△， 李曉鐘2， 路 娜1， 趙 艷1， 王 康1， 裴 毅3

(1山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室, 山西 太原 030001;2山西省人民醫(yī)院急診科,山西 太原 030012;3山西醫(yī)學科學院，山西大醫(yī)院老年腫瘤科, 山西 太原 030032)

目的探討絲氨酸/蘇氨酸激酶15 (serine/threonine kinase 15，STK15)過表達對人食管癌細胞株KYSE150生長的影響。方法采用脂質體法將pEGFP-C1-STK15真核表達載體轉染人食管鱗癌細胞株KYSE150，構建STK15過表達的穩(wěn)定細胞系(GFP-STK15)，通過熒光顯微鏡和Western blotting檢測STK15的表達。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法觀察STK15過表達對體外腫瘤細胞生長的影響。通過流式細胞術分析STK15過表達對細胞周期和凋亡的影響。采用裸鼠致瘤實驗觀察STK15過表達對體內腫瘤細胞生長的影響。結果pEGFP-C1-STK15質粒轉染細胞后篩選得到穩(wěn)定克隆，熒光顯微鏡顯示GFP-STK15融合蛋白定位于細胞的中心體以及紡錘體，Western blotting可檢測到GFP-STK15 融合蛋白的表達。與對照細胞相比，GFP-STK15細胞系的體外生長能力明顯增加；G0/G1期細胞百分率降低，細胞凋亡率減少；GFP-STK15細胞系接種組裸鼠腫瘤明顯增大，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論STK15過表達能促進人食管癌KYSE150細胞的生長，提示STK15將可能成為治療食管癌的新靶點。

絲氨酸/蘇氨酸激酶15； 食管腫瘤； 細胞增殖

絲氨酸/蘇氨酸激酶15 (serine/threonine kinase 15)，又名BTAK (breast tumor-amplified kinase)、Aurora-A、Aurora-2或AIK (Aurora/Ipl1 kinase)[1]。STK15在高等真核生物細胞分裂的過程中具有重要的作用，包括調節(jié)細胞周期G2/M轉變、中心體的分離與成熟、紡錘體的裝配以及胞質分裂等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，STK15在許多腫瘤包括食管癌中存在過表達[3-11]。為了進一步探討STK15在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們將pEGFP-C1-STK15真核表達載體轉染人食管鱗癌細胞，建立STK15過表達的穩(wěn)定細胞系，以研究其對體內外腫瘤細胞生長的影響，從而為腫瘤的治療尋求新的特異靶點。

材 料 和 方 法

1材料

人食管鱗癌KYSE150細胞購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫；pEGFP-C1 載體由本室保存；DH5α菌株由本室保存。限制性內切酶、DNA marker、T4 DNA 連接酶和逆轉錄酶及引物購自TaKaRa；質粒提取試劑盒購自Qiagen；RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清購自HyClone；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000 購自Invitrogen；STK15抗體購自Cell Signal；β-actin抗體購自Santa Cruz；裸鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。

2方法

2.1STK15 基因真核表達載體的構建及鑒定 用Trizol試劑抽提正常食管組織總RNA，以其為模板，逆轉錄成cDNA, 再以cDNA為模板擴增STK15基因。上游引物序列加入XhoⅠ酶切位點: 5’-GCCTCGAGGCATGGACCGATC-3’; 下游引物序列加入BamHⅠ酶切位點: 5’-CGGGATCCCTAAGACTGTTTG-3’。反應條件：94 ℃預變性5 min 后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，末次循環(huán)后72 ℃ 10 min。STK15基因的cDNA 擴增產物及pEGFP-C1載體均用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化。基因片段及載體由T4 DNA 連接酶連接后轉化DH5α細菌，挑取單克隆菌落進行擴大培養(yǎng)后提取質粒進行測序鑒定。同時經XhoⅠ單酶切以及XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，用1%瓊脂糖電泳鑒定。

2.2細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定轉染 KYSE150細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞達70%融合時，按LipofectamineTM2000說明書將pEGFP-C1-STK15重組質粒及空載體pEGFP-C1分別轉染入細胞內。48 h后加入G418篩選，14 d后獲得STK15穩(wěn)定表達克隆及對照克隆，并擴大培養(yǎng)，采用熒光顯微鏡和Western blotting鑒定。

2.3Western blotting檢測 腫瘤細胞或裸鼠腫瘤組織用PBS漂洗2遍, 加入細胞裂解液，置于冰上40 min，12 000 r/min離心20 min后, 收集上清即為細胞提取蛋白。經10% SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜，以STK15(1∶1 000稀釋)為Ⅰ抗，HRP標記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗，經孵育洗膜后ECL曝光顯影，檢測細胞內蛋白的表達水平，以β-actin為內參照。圖像分析系統(tǒng)測定灰度值。

2.4MTT法測定細胞生長曲線 將對數生長期的細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種3 000個細胞，設8個平行孔。分別在1、3、5、7和9 d以MTT法檢測其吸光度(A)。檢測前棄去上清，每孔加入100 μL含0.2 g/L MTT的無血清培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)4 h后棄去上清，并加入150 μL DMSO，混勻后，在酶標儀上用波長為570 nm測定A值，并繪制生長曲線。

2.5流式細胞術分析 胰酶消化并收集細胞，預冷的70%乙醇4 ℃固定過夜。加入RNase A(1 g/L)，37 ℃水浴30 min，再加入PI染色液(50 mg/L)，至4 ℃避光30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。以G2/M期和S期細胞百分比之和代表細胞的增殖能力。

2.6裸鼠致瘤實驗 裸鼠12只，隨機分為2組，每組各6只。分別取1×106個細胞懸浮于0. 2 mL PBS 中，在無菌條件下接種裸鼠(BALB/cnu/nu)左側前肢皮下，3個月后處死動物剝取瘤體，測量腫瘤體積并拍照。

2.7逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 參照Trizol 說明書提取裸鼠腫瘤組織總RNA，并逆轉錄成cDNA，再以cDNA 為模板，PCR 擴增STK15基因，上游引物5′-AATGATTGAAGGTCGGATGC-3′，下游引物5′-TTCTCTGAGCATTGGCCTCT-3′。以看家基因GAPDH 為內參照，上游引物5′-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3′，下游引物5′-GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT-3′。引物由TaKaRa合成。反應條件為：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30 個循環(huán)。圖像分析系統(tǒng)測定灰度值。

3統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5 軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間數據的比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1pEGFP-C1-STK15表達載體的構建及鑒定

真核表達載體pEGFP-C1 分子量大小為4.7 kb，在綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)讀碼框的C 端含有多克隆位點，可供外源基因插入，從而構建得到EGFP-C1-STK15重組質粒。pEGFP-C1和EGFP-C1-STK15載體單酶切后經瓊脂糖電泳，可見分子量約為4.7 kb和5.9 kb的片段。重組體雙酶切后經瓊脂糖電泳，可得到1條約為1.2 kb的目的片段和1條約為4.7 kb 的載體片段，見圖1，與預期結果相符，表明STK15基因已插入到pEGFP-C1載體中。測序進一步證實重組質粒中插入的目的基因片段大小、方向和插入位點均正確。

Figure 1. Identification of recombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector by enzyme digestion. 1: pEGFP-C1-STK15 digested byXhoⅠ+BamHⅠ; 2: pEGFP-C1-STK15 digested byXhoⅠ；3: pEGFP-C1 digested byXhoⅠ.

圖1重組質粒pEGFP-C1-STK15的酶切鑒定

2熒光鏡下觀察GFP-STK15的表達

pEGFP-C1-STK15載體穩(wěn)定轉染細胞后，熒光鏡下可觀察到綠色熒光，見圖2，GFP標記的STK15蛋白主要定位于細胞的中心體以及紡錘體(GFP-STK15)，這與文獻報道一致[2]，證明STK15載體構建成功并能在細胞中正確表達。pEGFP-C1轉染細胞后也可觀察到綠色熒光，GFP在胞質及胞核均有表達(control)。

3Westernblotting檢測STK15蛋白的表達

pEGFP-C1-STK15質粒轉染后篩選出4個穩(wěn)定克隆(將其命名為GFP-STK15)，可以檢測到分子量為73 kD的GFP-STK15融合蛋白。而空載體轉染后篩選到的5個細胞克隆并未檢測到此條帶(將其命名為control)，僅有1條內源性的STK15蛋白表達條帶，見圖3。而且，灰度分析顯示GFP-STK15細胞系中總STK15表達量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，證明STK15過表達穩(wěn)定細胞系構建成功。選取外源性STK15蛋白表達相對比較高的一株細胞克隆以及隨機選取一株空載細胞克隆進行后續(xù)實驗。

Figure 2. The location of GFP-STK15 protein in ESCC KYSE150 cell line detected by fluorescence microscopy.A:GFP-STK15;B:control.

圖2熒光鏡下觀察GFP-STK15在細胞內的表達

Figure 3. The expression of STK15 protein and GFP-STK15 fusion protein in ESCC KYSE150 cell line detected by Western blotting.

圖3Westernblotting鑒定STK15蛋白和GFP-STK15融合蛋白在腫瘤細胞中的表達

4STK15過表達對體外腫瘤細胞生長的影響

如圖4所示，GFP-STK15細胞系的生長能力明顯高于對照細胞，差異顯著(P<0.01)。

5STK15過表達對細胞周期和凋亡的影響

如表1所示，與對照組相比，GFP-STK15細胞系G0/G1期細胞百分率明顯降低，細胞增殖率明顯增加，細胞凋亡率有所減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

6STK15過表達對裸鼠腫瘤生長的影響

裸鼠接種腫瘤細胞1周后，可觀察到皮下腫瘤出現(xiàn)。3個月后處死裸鼠，隨機選取每組各1只裸鼠拍照，GFP-STK15細胞系接種組腫瘤明顯大于對照組，差異顯著(P<0.01)，見圖5。

Figure 4. Effects of STK15 overexpression on growth of ESCC KYSE150 cell line detected by MTT assay. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol.

圖4STK15過表達對體外腫瘤細胞生長的影響

表1STK15過表達對細胞周期和凋亡的影響

Table 1. Effects of STK15 overexpression on cell cycle distribution and apoptosis of ESCC KYSE150 cell line detected by flow cytometry (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1ProliferationrateApoptoticrateControl44.1±1.555.9±1.62.8±0.3GFP-STK1529.4±1.2**70.6±1.9**1.6±0.2**

**P<0.01vscontrol.

7RT-PCR和Westernblotting檢測STK15在裸鼠腫瘤組織中的表達

隨機選取3個GFP-STK15細胞系接種組和3個對照組裸鼠腫瘤組織，進行RT-PCR檢測，結果顯示，GFP-STK15細胞系接種組裸鼠腫瘤組織中STK15 mRNA表達水平明顯高于對照組，灰度分析顯示2組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖6A。Western blotting檢測結果顯示在GFP-STK15細胞系接種組裸鼠腫瘤組織中可檢測到GFP-STK15融合蛋白的表達，而對照組僅可檢測到內源性STK15蛋白的表達，灰度分析顯示2組STK15總蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖6B。

討 論

食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多基因、多分子水平變化的非常復雜的過程。研究表明，腫瘤抑癌基因p53、Rb和ras在食管癌中存在點突變；myc、cyclin D1等癌基因在食管癌中均有不同程度的擴增[9, 12]。近年來，一種參與有絲分裂的絲氨酸/蘇氨酸激酶——STK15備受關注，這是因為它與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。例如在乳腺癌[3]、肝癌[4]、卵巢癌[5]、鼻咽癌[6]、前列腺癌[7]、腎癌[8]等癌癥中均發(fā)現(xiàn)有STK15的過表達。另外在食管癌中也存在STK15的過表達，而且STK15的表達水平與食管癌的侵襲潛能和淋巴結轉移呈正相關[9-11]。因此，深入研究STK15在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將有助于進一步闡明食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。

Figure 5. Effects of STK15 overexpression on tumor growth of nude mice. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖5STK15過表達對裸鼠腫瘤生長的影響

本研究采用基因工程技術構建STK15基因的重組表達載體pEGFP-C1-STK15，通過雙酶切和測序鑒定均證實載體構建成功。而且，pEGFP-C1質粒含有GFP作為報告基因，在熒光顯微鏡下可顯示綠色熒光，該基因與目的基因STK15連接形成融合基因，不影響目的基因的表達[13]，可以追蹤目的基因STK15在細胞中的定位以及表達情況。因此，重組表達載體pEGFP-C1-STK15的成功構建為后續(xù)研究奠定了良好的實驗基礎。

本研究進一步采用脂質體法將重組表達載體pEGFP-C1-STK15穩(wěn)定轉染人食管鱗癌細胞，證實GFP-STK15主要定位于細胞的中心體以及紡錘體，說明pEGFP-C1-STK15載體能在細胞中正確表達。同時Western blotting進一步證實篩選得到了STK15過表達的穩(wěn)定細胞克隆。而且，我們發(fā)現(xiàn)STK15過表達能促進體外腫瘤細胞和體內裸鼠腫瘤細胞的生長，并使G0/G1期細胞百分率降低，細胞增殖率增加，細胞凋亡率減少，提示STK15過表達可能通過加速細胞周期進程和抑制細胞凋亡而促進腫瘤生長。與對照組相比，STK15過表達細胞系接種組裸鼠腫瘤組織中存在STK15過表達，進一步說明STK15過表達促進了裸鼠腫瘤的生長。Tanaka等[14]曾經報道，利用RNA干擾抑制STK15的表達，可以抑制腫瘤細胞的生長，與本文研究結果相一致。綜上所述，本研究初步揭示了STK15過表達對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響，因而為進一步闡明STK15的功能提供了一定的實驗和研究基礎，提示STK15將可能成為治療食管癌的新靶點。

Figure 6. The expression of STK15 mRNA (A) and protein (B) in tumor tissues of nude mice detected by RT-PCR (A) and Western blotting (B), respectively. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖6RT-PCR和Westernblotting檢測STK15在裸鼠腫瘤組織中的表達

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EffectsofSTK15overexpressionongrowthofhumanesophagealcarcinomacelllineKYSE150

WANG Xiao-xia1, LI Xiao-zhong2, LU Na1, ZHAO Yan1, WANG Kang1, PEI Yi3

(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofEmergency,ShanxiProvincialPeople’sHospital,Taiyuan030012,China;3DepartmentofGeriatricOncology,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Taiyuan030032,China.E-mail:wxiaoxia99007@126.com)

AIM: To investigate the effects of serine/threonine kinase 15 (STK15) overexpression on the growth of human esophageal squamous-cell carcinoma (ESCC) cell line KYSE150.METHODSRecombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector was transfected into KYSE150 cells using LipofectamineTM2000 and the expression of STK15 was detected by fluorescence microscopy and Western blotting. The proliferation of the cellsinvitrowas measured by MTT assay. The cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. The proliferation of the cellsinvivowas measured by tumorigenicity experiment in nude mice.RESULTSAfter recombinant pEGFP-C1-STK15 expression vector was stably transfected into KYSE150 cells, GFP-STK15 fusion protein localized to centrosome and spindle. The STK15-overexpressing colonies were further confirmed by Western blotting. MTT assay showed that the proliferation of the cells in STK15 overexpression group was increased compared with control group (P<0.01). Flow cytometry analysis showed that the percentage of the cells in G0/G1phase and the cell apoptosis in STK15 overexpression group were decreased compared with control group (P<0.01). The tumorigenicity experiment in nude mice showed that the proliferation of the cells in STK15 overexpression group was increased compared with control group (P<0.01).CONCLUSIONOverexpression of STK15 in human ESCC KYSE150 cells promotes the cell growthinvitroandinvivo, indicating that STK15 may serve as a novel therapeutic target for esophageal carcinoma.

Serine/threonine kinase 15; Esophageal neoplasms; Cell proliferation

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.007

1000- 4718(2013)11- 1957- 05

2013- 05- 10

2013- 07- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 30973401)；山西省自然科學基金資助項目(No. 2009011052)

△通訊作者 Tel: 0351-4135637； E-mail: wxiaoxia99007@126.com