鄰苯二甲酸二丁酯——蠟蚧霉代謝產(chǎn)物

高英，薛皎亮，熊琦，毛立新，謝映平

（山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

蠟蚧霉Lecanicilliurn lecanii（Zimmermann）（或蠟蚧輪枝菌Verticillium lecanii（Zimmermann）Gams＆Zare）是一種主要寄生同翅目、鱗翅目、纓翅目等昆蟲的重要昆蟲病原真菌，其地理分布和寄主范圍都非常廣泛，在分類上屬于子囊菌門Ascomycota，糞菌綱Sordariomycetes，肉座菌目 Hypocreales，麥角菌科Clavicip itaceae［1］.Nivter于1861年在錫蘭發(fā)現(xiàn)蠟蚧霉.自20世紀70年代以來，國內(nèi)外學者對其進行了廣泛研究，其研究主要集中在對蚜蟲［2－3］、粉虱［4－5］、蚧蟲［6－7］等害蟲的防治.昆蟲病原真菌分泌的毒素物質(zhì)在致死寄主的過程中起關鍵作用.蠟蚧霉代謝產(chǎn)物成分復雜.Kanaoka等［8］推斷蠟蚧霉菌絲體提取物環(huán)狀多肽球孢交酯對家蠶具有毒殺作用.Claydon等［9］（1982）研究認為蠟蚧霉代謝液中具有殺蟲活性的物質(zhì)為2，6－吡啶二羧酸，2，6－吡啶二羧酸鈉鹽對紅頭麗蠅（Calliphora erythrocephala）有毒性.研究表明蠟蚧霉菌絲體的毒素可能為磷脂類，但具體結構均不清楚［10－12］.

國內(nèi)外大量研究已證實動、植物和微生物可產(chǎn)生具有生理活性物質(zhì)的DBP.海洋來源的放線菌代謝產(chǎn)物中的抗腫瘤活性成分DBP對小鼠乳腺癌細胞（溫敏型tsFT210）具有G0／G1期細胞周期抑制作用［13］.放線菌SPRI0518次級代謝產(chǎn)物丙酮提取物DBP具有除草活性［14］.炭團菌活性物DBP對樟子松枯梢病菌具有較高抑菌作用［15］.鏈霉菌（Streptomyces）代謝物中的 DBP具有抗菌性能［16－17］和抑制水解酶α－糖苷酶、β－糖苷酶和α－甘露糖酶、β－甘露糖酶的作用［18］.作者利用高速逆流色譜（High speed counter current chromatography，HSCCC）分離純化了蠟蚧霉次生代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)該真菌產(chǎn)生鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl Phthalate，DBP）.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：蠟蚧霉菌株CGMCC NO.3.4505（從蚧蟲體上分離）與CGMCC NO.3.4504（從稻飛虱體上分離），購于中國科學院微生物研究所菌種保藏管理中心，儲存于4℃冰箱中備用.

主要儀器：半制備型逆流色譜儀（TBE－300A，上海同田生化技術有限公司產(chǎn)），ATKA Prime泵系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及組分收集系統(tǒng)，溫控恒溫水浴鍋（北京博康醫(yī)療器械有限公司），氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫GC－MS，Agilent 7890A－5975C），旋轉蒸發(fā)儀（上海申生），氣相色譜儀（GC－2010，日本島津）.

試劑：乙酸乙酯、乙醇、甲醇、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、葡萄糖均為分析純.

1.2 菌株的培養(yǎng)

將蠟蚧霉菌株NO.3.4505與NO.3.4504分別接入裝有PDA斜面培養(yǎng)基的試管中，放入培養(yǎng)箱中，于溫度25℃，相對濕度75%下培養(yǎng)7d，獲得一級菌種.

在100mL三角瓶中加入約40mL液體查氏培養(yǎng)基，高壓滅菌30min，冷卻后將一級菌種接種至液體查氏培養(yǎng)基，接種量為100mL三角瓶接1支一級斜面菌種，于25℃下恒溫震蕩培養(yǎng)7d獲得二級菌種.

在7L液體發(fā)酵罐中加入5L液體查氏培養(yǎng)基，高壓滅菌30min，待冷卻后，接種500mL二級菌種，通氣量按體積比1∶1，壓力0.1MPa在25℃培養(yǎng)10d.

1.3 代謝產(chǎn)物的提取

將培養(yǎng)好的菌株發(fā)酵液于5000r／min下離心15min，去除菌絲體.然后將上清液于50℃下減壓濃縮至原體積的1／5.在濃縮液中加入3倍體積乙醇進行醇沉，室溫下靜置24h，5000r／min下離心10min，去除沉淀.然后將上清液于50℃下減壓濃縮至原體積的1／5，得濃縮脫醇液.將等體積的乙酸乙酯萃取劑加入脫醇后的濃縮液中，超聲波萃取3次，將有機相合并濃縮干燥，用少量的乙酸乙酯重新溶解粗提物，干燥后得乙酸乙酯粗提物.

1.4 高速逆流色譜分離、純化粗提物

根據(jù)多次試驗結果，確定兩相溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水（4︰5∶4∶5，V／V），并將兩相溶劑用力充分混合后靜置過夜（切勿使用超聲波進行混合），使用前將兩相分離至兩試劑瓶中，超聲波脫氣30min，取上相為固定相，下相為流動相.將固定相以50mL／min的流速用泵充滿整個螺旋柱，啟動色譜儀，調(diào)節(jié)轉速為820r／min，流動相流速為1mL／min.當流動相從主機出口流出時體系已經(jīng)達到平衡，此時固定相保留值為70%.將乙酸乙酯粗提物100mg溶于10mL固定相中并用0.2μm有機濾膜過濾，然后將其打入樣品環(huán)后進行分離.大約450min后停止分離，將螺旋柱中的固定相用氮氣吹出收集，將收集液減壓濃縮，獲得菌株NO.3.4505與NO.3.4504代謝產(chǎn)生的無色油狀液體L3.4505與L3.4504.

1.5 GC與GC／MS分析

通過GC與GC／MS分析檢測無色油狀液體，確定收集樣品的化學成分.

GC／MS分析條件：柱溫45℃起，恒溫4min，以15℃／min的速率升溫至235℃并保保持25min，壓力26.4psi（0.182MPa），進樣量1μL，分流比10︰1，F(xiàn)FAP柱（30m×250μm×0.25μm），檢測器溫度250℃，接口溫度280℃，EI源溫度230℃，四級桿溫度150℃.

GC分析條件：柱溫80℃起，恒溫3min，以15℃／min的速率升溫至210℃并保保持3min，以10℃／min的速率升溫至280℃并保持10min，進樣量1μL，分流進樣20∶1，CP－8柱，F(xiàn)IT檢測器.

圖1 L3.4505GC／MS檢測的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of L3.4505with GC／MS

圖2 L3.4505離子流色譜圖中峰I與DIBP質(zhì)譜圖比較Fig.2 Comparison of mass spectra of the peak I of L3.4505and DIBP

圖3 L3.4505離子流色譜圖中峰II與DBP質(zhì)譜圖比較Fig.3 Comparison of mass spectra of the peak II of L3.4505and DBP

2 結果與分析

應用GC／MS對無色油狀液體檢測.從無色油狀液體L3.4505GC／MS離子流色譜圖（圖1，P97）可知其組分較純，圖1中峰I、峰II的質(zhì)譜與譜庫檢索質(zhì)譜比較見圖2與圖3，分析峰II為DBP（RT＝33.356，質(zhì)量匹配數(shù)97），峰I為鄰苯二甲酸二異丁酯（Diisobutyl Phthalate DIBP，RT＝28.848），面積歸一法計算峰II的相對含量為98%.比較無色油狀液體L3.4505（圖4，P99）和標準品DBP（圖5，P99，RT＝17.849）、DIBP（圖6，P99，RT＝16.709）的氣相色譜圖，結果二者的出峰時間均相同，證明無色油狀液體L3.4505主要為DBP.無色油狀液體L3.4504的GC／MS離子流色譜圖見圖7（P100），譜庫檢索結果無色油狀液體L3.4504為DBP.

圖4 L3.4505氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of L3.4505

圖5 DBP氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of DBP

圖6 DIBP氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of DIBP

3 討論

本研究利用高速逆流色譜首次從兩株蠟蚧霉菌株的代謝液中分離得到DBP.Savard等曾從青霉菌（Penicillium bilaii）PB－50的次級代謝產(chǎn)物中分離得到DBP［19］.中藥材懷牛膝的有效生理活性物質(zhì)中含有DBP［20］.云南干巴菌中DBP的相對含量為2.25%［21］.Chen等在人造海水中培養(yǎng)的紅藻（Bangia atropurpurea）同樣也產(chǎn)生DBP，且不同藻類在同一環(huán)境中的產(chǎn)量差異顯著，表明DBP是由于藻類內(nèi)在的固有性質(zhì)決定的［22］.兩種可食褐藻（Undaria pinnatifida 和Laminaria japonica）和綠藻（Ulvasp.）代謝可產(chǎn)生含豐富的天然14C的DBP［23］.Basaran首次從一株產(chǎn)黃曲霉毒素的寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）代謝產(chǎn)物中提取得到DBP［24］.Ruikar從槍彈木（Mimusops elengi）中首次分離出DBP［25］.Pfordt檢測沒有任何確定污染的31種食品和人乳中的鄰苯二甲酸二丁基鹽（酯）的濃度為10～51mg／kg［26］.

圖7 L3.4504GC／MS檢測的總離子流色譜圖Fig.7 Total ion chromatogram of L3.4504with GC／MS

4 結論

本次研究利用高速逆流色譜，以正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水（4∶5∶4∶5）為兩相溶劑系統(tǒng)，首次從兩株昆蟲病原真菌蠟蚧霉的次生代謝產(chǎn)物中分離得到DBP.本研究對開發(fā)生物資源進行害蟲生物防治具有重要意義.

［1］Sung G H，Sung J M，Hywel－Jones N L.A multi－genephylogeny of Clavicip Itaceae（Ascomycota，F(xiàn)ungi）：Identification of Localized Incongruence Using a Combinational Bootstrap Approach［J］.Molecular Phy logenetics and Evolution，2007，44：1204－1223.

［2］Askary H，Benhamou N，Brodeur J.Ultrastructural and Cytochemicalcharacterization of Aphid Invasion by the Hyphomycete Verticillium Lecanii［J］.Journal of Invertebrate Pathology，1999，74（1）：1－13.

［3］Lee J Y，Kang S W，Yoon S S，et al.Verticillium Lecanii Spore Formulation Using UV Protectant and Wetting Agent and the Biocontrol of Cotton Aphids［J］.Biotechnology Letter，2006，28：1041－1045.

［4］Gindin G，Geschtovt N U，Raccah B，et al.Pathogenicity of Verticillium Lecanii to Different Developmental Stages of the Silverleaf Whitefly，Bemisia Argentifolii［J］.Phytoparasitica，2000，28（3）：229－239.

［5］Cuthbertson A G，Walters K F.Pathogenicity of the Entomopathogenic Fungus，Lecanicillium Muscarium，Against the Sweet Potato Whitefly，Bemisia Tabaci Under Laboratory and Glasshouse Conditions［J］.Mycopathologia，2005，160（4）：315－319.

［6］Liu W M，Xie Y P，Xue J L，et al.Histopathological Changes of Ceroplastes Japonicus Infected by Lecanicillium Lecanii［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，101：96－105.

［7］Liu W M，Xie Y P，Xue J L，et al.Ultrastructural and Cytochemical Characterization of Brown Soft Scale Coccus Hesperidum （Hemiptera：Coccidae）Infected by the Lecanicillium Lecanii（Ascomycota：Hypocreales）［J］.Micron，2011，42：71－79.

［8］Kanaoka M，Isogai A，urakoshi S，et al.Bassianolide，a new Insecticidal Cyclodepsipeptide from Beauveria Bassiana and Verticillium Lecanii［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1978，42 （3）：629－635.

［9］Claydon N，Grove J F.Insecticidal Secondary Metabolic Products from the Entomoenous Fungus Vercillicum Lecanii［J］.Journal of Invertebrate Pathology，1982，40：413－418.

［10］Gindin G，Barash I，Harari N，et al.Effect of Endotoxin Compounds Isolated from Verticillium Lecanii on the Sweet Potato Whitefly，Bemisia Tabaci［J］.Phytoparasitica，1994，22 （3）：189－196.

［11］秦小萍，張亞平，楊美林，等.蠟蚧輪枝菌 Km9803代謝產(chǎn)物對蚜蟲的毒殺作用［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2009，18（1）：159－161.

［12］王聯(lián)德.蠟蚧輪枝菌毒素及其對煙粉虱種群控制作用的研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學博士學位論文，2003.

［13］曲新顏，顧謙群，崔承彬，等.海洋來源的放線菌3295代謝產(chǎn)物的結構鑒定及抗腫瘤活性（I）［J］.中國海洋藥物雜志，2004，23（6）：1－4.

［14］張李桃，孫軍利，顧學斌，等.放線菌SPRI0518次級代謝產(chǎn)物的分離提純及結構鑒定［J］.化學與生物工程，2006，23（9）：29－31.

［15］宋瑞清，高海燕.炭團菌提取物對樟子松枯梢病菌的抑菌活性及穩(wěn)定性［J］.微生物學報，2009，49（7）：910－917.

［16］El－Naggar M Y M.Dibutyl Phthalate and the Antitumor Agent F5A1，Two Metabolites Produced by Streptomyces nasrisubmutant H35［J］.Biomed Lett，1997，55：125－131.

［17］Roy R N，Laskar S，Sen S K.Dibutyl Phthalate，the Bioactive Compound Produced by Streptomyces Albidoflavus 321.2［J］.Microbiological Research，2006，161：121－126.

［18］Lee D S.Dibutylphthalate，anα－glucosidase Inhibitor from Streptomyces Melanosporofaciens［J］.Journal of Bioscence and Bioengineerwg，2000，89：271－273.

［19］Savard M E，Miller J D，Blais L A，et al.Secondary Metabolism of Penicillium Bilaii Strain PB－50［J］.Mycopathologia，1994，127（1）：19－27.

［20］韋松，梁鴻，趙玉英，等.懷牛膝中化合物的分離鑒定［J］.中國中藥雜志，1997，22（5）：293－295.

［21］呂瑜平，文凈，朱偉明.云南干巴菌揮發(fā)油化學成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，13（1）：39－41.

［22］Chen C Y.Biosynthesis of Di－（2－ethylhexyl）Phthalate（DEHP）and di－n－butyl Phthalate（DBP）from Red Alga－Bangia Atropurpurea［J］.Water Research，2004，38：1014－1018.

［23］Michio Namikoshi，Takeshi Fujiwara，Teruaki Nishikawa and Kazuyo Ukai.Natural Abundance14C Content of Dibutyl Phthalate（DBP）from Three Marine Algae［J］.Marine Drugs，2006，4：290－297.

［24］Basaran P，Demirbas R M.Spectroscopic Detection of Pharmaceutical Compounds from an Aflatoxigenic Strain of Aspergillus Parasiticus［J］.Microbiological Research，2010，165：516－522.

［25］Ruikar A D，Gadkari T V，Phalgune U D，et al.Dibutyl Phthalate，a Secondary Metabolite from Mimusops Elengi［J］.Chemistry of Natural Compounds，2011，46（6）：955－956.

［26］Pfordt J.Levels of Di（2－ethylhexyl）Phthalate（DEHP）and Dibutyl Phthalates in Some Food Stuffs with Plastic Packagings and in Mother’s Milk［J］.Deutsche Lebensmittel Rundschau，2004，100：431－436.