硫化氫對(duì)擬南芥在干旱脅迫條件下的生理影響

金竹萍，方慧慧，張麗萍，羅雅楠，喬增杰，龔澤華，裴雁曦＊

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051）

硫化氫（H2S）在常溫下是一種無(wú)色有臭雞蛋氣味的氣體，長(zhǎng)期以來(lái)一直被科學(xué)家們當(dāng)成有毒氣體看待，認(rèn)為它對(duì)人體有害無(wú)益.直到2008年楊廣東等在Science發(fā)表論文，表明H2S參與了生理性血管擴(kuò)張和血壓的調(diào)節(jié)，將H2S的研究推向一個(gè)高峰［1］.之后越來(lái)越多的證據(jù)表明H2S在動(dòng)物體中是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的又一種氣體信號(hào)分子［2－3］.

植物體的內(nèi)源H2S主要以L／D－半胱氨酸為底物，通過(guò)半胱氨酸脫巰基酶催化產(chǎn)生H2S、丙酮酸鹽和NH3；也可以通過(guò)葉片吸收大氣中的H2S；或者在亞硫酸鹽還原酶的作用下，將SO2－3直接還原成H2S［4］.植物中已經(jīng)克隆到與內(nèi)源H2S產(chǎn)生直接相關(guān)的基因：L型半胱氨酸脫巰基酶編碼基因（L－cysteine desulphydrase，LCD）At3g62130［5］和D型半胱氨酸脫巰基酶編碼基因（D－cysteine desulphydrase，DCD）At1g48420［6］.H2S在植物體內(nèi)生理作用的研究剛剛起步，相繼有報(bào)道證實(shí)H2S可增強(qiáng)植物的抗氧化脅迫能力，增加植物非生物脅迫抗性［7－10］、促進(jìn)根的形成和種子的萌發(fā)等［11－12］.目前絕大多數(shù)研究停留在外源施加H2S供體后，對(duì)供試材料進(jìn)行表型觀察和生理生化指標(biāo)測(cè)定，而對(duì)內(nèi)源H2S在植物體內(nèi)重要生理作用的機(jī)制卻知之甚少.

本文通過(guò)聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫，以擬南芥野生型和H2S產(chǎn)生酶的編碼基因LCD的缺失突變體為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)脅迫前后種子萌發(fā)率和抗氧化酶等活性的測(cè)定，揭示了內(nèi)源H2S對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）在干旱脅迫條件下的生理影響.

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥生態(tài)型Columbia；購(gòu)買(mǎi)美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)（ABRC）的T－DNA插入突變體lcd（SALK＿082099）種子，經(jīng)分子鑒定，雜合植株自交獲得純合株系.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

PEG處理參考張依章等的方法［13］，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，質(zhì)量濃度（g／mL）梯度設(shè)定為0、0.1、0.15、0.17、0.19、0.25、0.3.播種消毒后的野生型（wild type，WT）種子，200粒／皿，每個(gè)PEG濃度梯度重復(fù)3次.置于人工氣候箱內(nèi)，（23±1）℃，光照強(qiáng)度2000lx，16h光照／8h黑暗周期培養(yǎng).1周后記錄種子的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.萌發(fā)率

將種子萌發(fā)率為50%的PEG濃度作為種子萌發(fā)的半抑制濃度.在半抑制濃度的培養(yǎng)基上同時(shí)播種WT和lcd種子，培養(yǎng)1周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率進(jìn)行比較.

將1／2MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2周的WT和lcd幼苗取出并分為兩部分：一部分進(jìn)行H2S產(chǎn)率測(cè)定和材料脫水處理［7］，

另一部分幼苗的根部浸泡于0.3g／mL PEG溶液中5h，分別將脅迫前后的材料用50mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7.8）提取粗蛋白.超氧化物歧化酶SOD活性采用A001－1試劑盒（南京建成生物公司）測(cè)定；過(guò)氧化氫酶CAT、過(guò)氧化物酶POD、抗壞血酸過(guò)氧化物酶APX的活性及丙二醛MDA含量測(cè)定參考李忠光等的方法［14］；過(guò)氧化氫 H2O2的測(cè)定方法采用DAB顯色法［15］.

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS Statistics 17.0分析軟件進(jìn)行單因素比較，P＜0.05和P＜0.01分別為差異顯著和差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG干旱脅迫下WT和lcd的種子萌發(fā)

選取狀態(tài)一致的WT種子，在上述不同PEG濃度條件下培養(yǎng)1周，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.結(jié)果顯示：對(duì)照組的萌發(fā)率為100%，隨著PEG濃度的升高，萌發(fā)率逐漸降低.PEG濃度為0.17g／mL時(shí)，萌發(fā)率降低為50%，是擬南芥WT種子萌發(fā)的半抑制濃度；當(dāng)PEG濃度增加到0.25g／mL時(shí)，WT種子的萌發(fā)受到完全抑制.以0.17g／mL PEG為培養(yǎng)濃度，同時(shí)播種Col和lcd種子，1周后再觀察其萌發(fā)情況，結(jié)果如圖1（a）所示.WT的萌發(fā)率大約為50%，lcd種子萌發(fā)率與之相比下降約40%，兩者的差異極顯著（P＜0.01）.

圖1 WT和lcd的H2S產(chǎn)率（b）、失水率（c）及其在干旱脅迫下的種子萌發(fā)率（a）Fig.1 H2S production rate（b），water loss rate（c）and germination rate（a）of WT and lcd under drought stress

2.2 WT和lcd的H2S產(chǎn)率和失水率

為探究萌發(fā)率差異的原因，對(duì)兩種材料的H2S產(chǎn)率和失水率進(jìn)行了測(cè)定.突變體lcd的H2S產(chǎn)率僅為WT的61.86%，兩者存在顯著差異（P＜0.05）（圖1b）；隨著脫水時(shí)間的延長(zhǎng)，lcd的失水速度明顯較 WT快（圖1c），且表現(xiàn)為更嚴(yán)重的萎蔫狀態(tài).為了進(jìn)一步揭示內(nèi)源H2S對(duì)植物體在干旱脅迫下的作用機(jī)制，測(cè)定以下相關(guān)的生理指標(biāo).

2.3 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥體內(nèi)H2O2的影響

H2O2是對(duì)植物體具有極強(qiáng)毒害作用的活性氧，幾乎能氧化所有的細(xì)胞組分.采用DAB顯色法來(lái)顯示葉片中H2O2的含量，結(jié)果如P116圖2（a）所示.脅迫前的野生型WT葉片中幾乎沒(méi)有H2O2，而突變體lcd葉片內(nèi)H2O2較多.PEG干旱脅迫后，WT和lcd葉片中的H2O2斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加，尤其是lcd中的斑點(diǎn)更密集、顏色更深.

2.4 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥體內(nèi)MDA的影響

MDA含量可以反映植物膜脂過(guò)氧化的水平和對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度.圖2（b）所示是野生型WT和突變體lcd在PEG處理后體內(nèi)MDA含量的變化情況.可以看出，在PEG脅迫前，WT體內(nèi)MDA含量為lcd的80%，但沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）.經(jīng)過(guò)PEG脅迫處理后，WT和lcd體內(nèi)MDA含量均增加，且兩者相差1.56倍，差異極顯著（P＜0.01）.

2.5 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的酶，通過(guò)POD活性可以了解某一時(shí)期植物體內(nèi)生理代謝的變化.由圖2（c）得知，脅迫前野生型 WT的POD活性與突變體lcd相比，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）.隨著PEG的脅迫，其活性在二者體內(nèi)均有明顯的升高，WT在脅迫處理后POD活性提高了28.64%；而lcd則比處理前相比提高了2.11倍，與脅迫后的WT相比具極顯著差異（P＜0.01）.

2.6 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥CAT活性的影響

CAT在活性氧（ROS）代謝過(guò)程中，將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，使生物機(jī)體免受H2O2的毒害作用.由圖2（d）可知，在正常培養(yǎng)條件下，野生型WT體內(nèi)CAT的活性較低，突變體lcd與其相比具有顯著差異（P＜0.05）.經(jīng)過(guò)PEG脅迫后，lcd的CAT活性為脅迫前的1.84倍，差異極顯著（P＜0.01），且與 WT相比也有極顯著增加（P＜0.01）.

2.7 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥SOD活性的影響

SOD可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，生成H2O2，然后再進(jìn)一步被CAT轉(zhuǎn)化.因此SOD可看作是植物抗氧化的第一道防線.從圖2（e）可以看出，PEG脅迫前野生型WT的SOD活性與突變體lcd相比，沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）.PEG脅迫處理后，WT和lcd的SOD活性分別提高了1.26倍和2.22倍，且兩者之間具有極顯著差異（P＜0.01）.

2.8 H2S對(duì)干旱脅迫下擬南芥APX活性的影響

APX在ROS代謝過(guò)程中，以還原型抗壞血酸為底物對(duì)H2O2進(jìn)行清除，使脂質(zhì)過(guò)氧化作用減弱.從圖2（f）可以看出，脅迫前的突變體lcd與野生型 WT相比，APX活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）.經(jīng)過(guò)PEG進(jìn)行脅迫之后，WT和lcd的APX活性均有極顯著增加（P＜0.01），分別為脅迫前的1.23倍和1.37倍，且脅迫后的WT和lcd的APX活性相比差異顯著（P＜0.05）.

3 討論

H2S作為重要的氣體信號(hào)分子，在植物生命活動(dòng)中的作用已受到越來(lái)越多的關(guān)注.隨著研究的不斷深入，外源H2S對(duì)植物體的生理作用表現(xiàn)得更加全面.張華等研究了H2S供體NaHS對(duì)Cd和Cu脅迫下小麥種子萌發(fā)的影響，說(shuō)明外源H2S能顯著促進(jìn)小麥種子中淀粉酶與酯酶的活性上升［12，16］.本研究以擬南芥野生型和H2S體內(nèi)生成的關(guān)鍵酶編碼基因LCD敲除突變體為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定了PEG干旱脅迫后的種子萌發(fā)率.結(jié)果表明突變體lcd中由于LCD基因表達(dá)量下降，植株體內(nèi)H2S的產(chǎn)率降低，使得其種子萌發(fā)率較WT降低40%，具有極顯著差異（P＜0.01），進(jìn)一步揭示了內(nèi)源H2S可促進(jìn)植物種子萌發(fā)的作用機(jī)制.

圖2 WT和lcd在PEG脅迫下H2O2、MDA含量及各種抗氧化酶活性的比較Fig.2 Comparison of H2O2，MDA content and antioxidant enzymes activity under drought stress

此外，陸續(xù)有報(bào)道表明，外源H2S可作為一種抗氧化信號(hào)分子，提高植物的抗旱性［7－9］、緩解鉻和銅等重金屬毒性［10，12］.植物處在干旱和重金屬等非生物脅迫的環(huán)境中時(shí)，會(huì)直接或間接地產(chǎn)生活性氧（ROS）［17］，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用.植物體在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，進(jìn)化出一套完整的酶促保衛(wèi)系統(tǒng)，包括SOD、POD、CAT和APX等，能夠清除大量自由基，從而降低或消除ROS對(duì)脂膜的傷害.有研究結(jié)果表明，在干旱、重金屬等非生物脅迫條件下，外源施加H2S供體可使抗氧化酶的活性升高，MDA和H2O2的含量下降［9－10，12］.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：WT和lcd在PEG脅迫處理前，H2O2的斑點(diǎn)密度和顏色及略高的MDA含量，表明突變體lcd已有H2O2的積累，但大部分抗氧化酶的活性都未呈現(xiàn)顯著差異；而經(jīng)PEG脅迫處理后，H2O2的積累量和MDA含量極顯著增加，SOD、POD和CAT活性較處理前均有不同幅度的增加，而且lcd與WT相比也有極顯著差異（P＜0.01）.也就是說(shuō)，正常生長(zhǎng)條件下，WT和lcd中的H2O2含量無(wú)顯著差異，因此兩者的抗氧化酶活性差異不顯著（P＞0.05）.經(jīng)PEG脅迫處理后，由于H2S信號(hào)的缺失，使得lcd中H2O2的含量增加，氧化損傷的程度更為嚴(yán)重，植物通過(guò)提高抗氧化酶活性，達(dá)到清除ROS的目的.因此在干旱脅迫條件下，H2S對(duì)ROS的清除有促進(jìn)作用，可能與植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)是平行關(guān)系，兩者共同作用最終清除ROS.這與外源NO可以使重金屬As脅迫下的水稻抗氧化酶活性下降的結(jié)果相一致［18］.

［1］Yang G，Wu L，Jiang B，et al.H2S as a Physiologic Vasorelaxant：Hypertension in Mice with Deletion of Cystathionine Gamma－lyase［J］.Science，2008，322：587－590.

［2］Sanderson K.Emissions Control，Could Hydrogen Sulphide be the New Nitric Oxide？Katharine Sanderson Reports on the Rotten－egg Gas That is Earning a Reputation in Human Physiology［J］.Nature，2009，459：500－502.

［3］Pei Y X，Wu B，Cao Q H，et al.Hydrogen Sulfide Mediates the Anti－survival Effect of Sulforaphane on Human Prostate Cancer Cells［J］.Toxicol App Pharmaco，2011，257：420－428.

［4］Papenbrock J，Riemenschneider A，Kamp A，et al.Characterization of Cysteine－Degrading and H2S－Releasing Enzymes of Higher Plants－From the Field to the Test Tube and Back［J］.Plant Biol，2007，9：582－588.

［5］Harrington H M，Smith I K.Cysteine Metabolism in Cultured Tobacco Cells［J］.Plant Physiol，1980，65（1）：151－155.

［6］Soutourina J，Blanquet S，Plateau P.Role of D－cysteine Desulfhydrase in the Adaptation of Escherichia coli to D－cysteine［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276：40864－40872.

［7］Jin Z P，Shen J J，Qiao Z J，et al.Hydrogen Sulfide Improves Drought Resistance in Arabidopsis Thaliana［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，414：481－486.

［8］Zhang H，Ye Y K，Wang S H，et al.Hydrogen Sulfide Counteracts Chlorophyll Loss in Sweet Potato Seedling Leaves and Alleviates Oxidative Damage Against Osmotic Stress［J］.Plant Growth Regul，2009，58：243－250.

［9］Zhang H，Jiao H，Jiang C X，et al.Hydrogen Sulfide Protects Soybean Seedlings Against Drought－induced Oxidative Stress［J］.Acta Physiol Plant，2010a，32：849－857.

［10］Zhang H，Hu L Y，Hu K D，et al.Hydrogen Sulfide Alleviated Chromium Toxicity in Wheat［J］.Biol Plantaru，2010，54：74－747.

［11］Zhang H，Tang J，Liu X P，et al.Hydrogen Sulfide Promotes Root Organogenesis in Lpomoea Batatas，Salix Matsudana and Glycine Max ［J］.J Integr Plant Biol，2009，51：1086－1094.

［12］Zhang H，Hu L Y，Hu K D，et al.Hydrogen Sulfide Promotes Wheat Seed Germination and Alleviates the Oxidative Damage Against Copper Stress［J］.J Integr Plant Biol，2008，50：1518－1529.

［13］張依章，王幼寧，張文勝，等.聚乙二醇模擬水分脅迫篩選擬南芥突變體的新方法 ［J］.植物生理學(xué)通訊，2006，42（2）：285－287.

［14］李忠光，李江鴻，杜朝昆，等.在單一提取系統(tǒng)中同時(shí)測(cè)定五種植物抗氧化酶 ［J］.云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，22（6）：44－48.

［15］張蜀秋.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程 ［M］.北京：科學(xué)出版社，2011：56－58.

［16］焦浩.硫化氫調(diào)控脅迫條件下植物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的信號(hào)機(jī)制［D］.合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2010.

［17］Jami S K，Clark G B，Turlapati S A，et al.Ectopic Expression of an Annexin from Brassica Juncea Confers Tolerance to Abiotic and Biotic Stress Treatments in Transgenic Tobacco［J］.Plant Physiol Biochem，2008，46：1019－1030.

［18］Singh H P，Kaur S，Batish D R，et al.Nitric Oxide Alleviates Arsenic Toxicity by Reducing Oxidative Damage in the Roots of Oryza Sativa （rice）［J］.Nitric Oxide，2009，20：289－297.