沉默ABCC4基因表達對人胰腺癌PANC1、BxPC-3細胞增殖的影響

馬瑾 張卓 王建承

·論著·

沉默ABCC4基因表達對人胰腺癌PANC1、BxPC-3細胞增殖的影響

馬瑾 張卓 王建承

目的檢測ABCC4基因沉默后對人胰腺癌PANC1、BxPC-3細胞增殖及細胞周期的影響。方法構(gòu)建插入靶向ABCC4的shRNA片段的重組慢病毒載體，感染人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1和BxPC-3。采用實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測感染細胞的ABCC4 mRNA及蛋白表達，克隆形成實驗測定感染細胞形成的克隆數(shù)，流式細胞儀檢測感染細胞的細胞周期。結(jié)果成功構(gòu)建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重組慢病毒載體。重組慢病毒感染PANC1及BxPC-3細胞后，細胞ABCC4 mRNA表達被抑制(0.28±0.01比1.00±0.03，0.22±0.02比1.00±0.03，P值均<0.05)；ABCC4蛋白表達亦顯著下調(diào)；感染的PANC1細胞克隆形成數(shù)量顯著減少(4比65，P<0.05)；細胞周期阻滯在G1期[(54.98±1.78)%比(42.93±0.88)%，(68.55±0.75)%比(54.76±0.29)%]。結(jié)論沉默人胰腺癌PANC1和BxPC-3細胞的ABCC4基因表達可顯著抑制癌細胞的增殖，使細胞阻滯于G1期。

胰腺腫瘤； ABCC4； 細胞增殖； RNA干擾； 慢病毒感染

ABCC4(ATP-binding cassette sub-family C member 4)又稱MRP4(multi-drug resistance-associ-ated protein 4)，是Cole等在研究小細胞肺癌過程中發(fā)現(xiàn)的耐藥基因家族[1]。人類的ABCC4定位于染色體13q32，轉(zhuǎn)錄編碼該家族中分子量最小的蛋白。文獻報道[2]，ABCC4參與多種細胞對核苷酸類似物如6-巰基嘌呤及硫鳥嘌呤等抗腫瘤藥物的耐藥。然而，有關(guān)ABCC4基因在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中對腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移所起的作用尚未見報道。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)將靶向ABCC4的干擾片段通過慢病毒載體感染胰腺癌PANC1及BxPC-3細胞，觀察感染后細胞的增殖及細胞周期的變化。

材料與方法

一、慢病毒載體的構(gòu)建和人胰腺癌細胞的感染

針對ABCC4基因設(shè)計靶向ABCC4的shRNA(ABCC4-shRNA)和陰性對照的shRNA-C。ABCC4-shRNA序列為5′-CTAGCCCGGGCACTCATTAAA-TCACAAGAACTCGAGTTCTTGTGATTTAATGAGTGC-TTTTTTGTTAAT-3′，siRNA-C序列為5′-CTAGCC-CGGTTCTCCGAACGTGTCACGTATCTCGAGATACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTTTAAT-3′。兩端分別添加了Age I和EcoR I酶切位點，由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計合成。慢病毒載體PGCSIL-GFP購自中國上海吉凱公司。通過酶切慢病毒載體與shRNA連接，構(gòu)建重組慢病毒載體。重組慢病毒通過慢病毒包裝質(zhì)粒共同感染HEK 293T細胞，常規(guī)培養(yǎng)。收集和濃縮培養(yǎng)上清液，獲得含有ABCC4-shRNA或shRNA-C的重組慢病毒。

人胰腺癌細胞系PANC1及BxPC-3購自中科院上海生命科學(xué)院細胞資源中心，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。按104個細胞密度接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將重組病毒感染胰腺癌細胞(感染復(fù)數(shù)為10)，按說明書操作，以未感染慢病毒的細胞作為對照。

二、實時定量PCR

收集各組感染后培養(yǎng)5 d的胰腺癌細胞，采用Trizol(Invitrogen公司)抽提細胞總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用標(biāo)準(zhǔn)SYBR Green RT-PCR試劑盒(Takara公司)檢測細胞ABCCR mRNA的表達，按說明書操作。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45個循環(huán)。通過PCR儀自帶軟件讀取原始Ct值，采用2-△△Ct公式計算mRNA相對表達量。

三、蛋白質(zhì)印跡法

收集各組慢病毒感染7 d的胰腺癌細胞，采用細胞裂解液裂解細胞，離心取上清液，測蛋白濃度后，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測ABCC4蛋白，以GAPDH為內(nèi)參。羊抗人ABCC4多抗購自美國Santa Cruz公司。ECL+plusTM Western blotting system試劑盒購自美國Pierce Chemical公司，按說明書操作。

四、四甲基偶氮唑藍(MTT)法

取各組對數(shù)生長期慢病毒感染5 d的PANC1細胞制成細胞懸液，以每孔4×103個細胞密度接種于96孔板分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加100 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩10 min，上酶標(biāo)儀測各孔570 nm處的吸光度(A570)值，繪制細胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

五、克隆形成實驗

取各組對數(shù)生長期慢病毒感染5 d的細胞，于6孔培養(yǎng)板中各加入300個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)2周后用多聚甲醛1 ml固定細胞60 min，Giemsa液500 μl染色細胞20 min，雙氧水清洗，熒光顯微鏡下觀察克隆形成情況。

六、細胞周期檢測

取各組對數(shù)生長期慢病毒感染5 d的細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌液清洗2次，加900 μl預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜，加入碘化丙錠(PI)染色，300目的篩網(wǎng)過濾，上流式細胞儀檢測細胞周期。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細胞ABCC4基因表達量的變化

約90%的慢病毒感染5 d的PANC1或BxPC-3細胞在熒光顯微鏡下均表達綠色熒光蛋白(GFP)，表明慢病毒的感染率達到90%以上(圖1)。感染ABCC4-shRNA重組慢病毒[RNAi(+)]的PANC1及BxPC-1細胞的ABCC4 mRNA表達量分別為0.28±0.01和0.22±0.02，而感染shRNA-C重組慢病毒[RNAi(-)]的PANC1及BxPC-1細胞的ABCC4 mRNA表達量分別為1.00±0.03和1.00±0.03，RNAi(+)細胞較RNAi(-)細胞的表達量顯著下調(diào)(P值均<0.05)；RNAi(+)的PANC1和BxPC-1細胞ABCC4蛋白表達亦較RNAi(-)的相應(yīng)細胞顯著下調(diào)(圖2)。

圖1慢病毒感染的胰腺癌PANC1(a、b)和BxPC-1(c、d)細胞(a、c：白光視野，b、d：綠色熒光視野 ×100)

1:RNAi(-)；2:RNAi(+)

圖2感染重組慢病毒的PANC1(a)、BxPC-3(b)細胞的ABCC4蛋白表達

二、胰腺癌細胞生長曲線的變化

RNAi(+)的PANC1、BxPC-3細胞的生長曲線均較RNAi(-)的相應(yīng)細胞的生長曲線低而平(圖3)。

圖3感染重組慢病毒的PANC1(a)、BxPC-3(b)細胞的生長曲線

三、胰腺癌PANC1細胞克隆形成能力的變化

RNAi(+)及RNAi(-)的PANC1細胞的克隆形成數(shù)量分別為4個和65個，RNAi(+)的PANC1細胞克隆形成數(shù)顯著減少(P<0.05，圖4)。

四、胰腺癌細胞周期的變化

RNAi(+)的PANC1和BxPC-3細胞的G1期細胞數(shù)較RNAi(-)的相應(yīng)細胞顯著增加，而S期細胞數(shù)顯著減少，提示ABCC4基因沉默后胰腺癌細胞的生長阻滯于G1期(圖5，表1)。

圖4 形成的PANC1細胞克隆

圖5 感染重組慢病毒的PANC1、BxPC-3細胞的周期變化

細胞細胞數(shù)G1SG2/MPANC1RNAi(-)42.93±0.8837.66±1.4219.42±0.7RNAi(+)54.98±1.7822.24±5.2122.78±3.44BxPC-3RNAi(-)54.76±0.2939.27±1.795.97±1.25RNAi(+)68.55±0.7520.78±3.0810.67±2.39

討 論

目前， ATP結(jié)合蛋白超家族已經(jīng)擁有了13個成員。研究結(jié)果顯示，ABCC4在肺癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中均有不同程度的高表達。在神經(jīng)母細胞瘤中，ABCC4的高表達與腫瘤的預(yù)后呈顯著的正相關(guān)。ABCC4的高表達與多種實體瘤對藥物及其結(jié)合代謝產(chǎn)物、鉑類化合物、葉酸抗代謝物、腺苷及腺苷類似物的耐藥有關(guān)[3]。在胰腺癌中，ABCC4被證實可以影響癌細胞對5-FU藥物的敏感性，在5-FU耐藥細胞中特異性表達上調(diào)[4-5]。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了插入靶向ABCC4的shRNA片段的重組慢病毒載體，感染人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1和BxPC-3后可沉默ABCC4基因的表達。研究結(jié)果顯示，ABCC4基因表達沉默后的PANC1和BxPC-3細胞的增殖被顯著抑制，克隆形成能力極弱，推測ABCC4可能是一個促癌基因。通過對細胞周期的檢測，PANC1和BxPC-3細胞的增殖被阻滯在G1期，也就是細胞DNA合成期，進一步表明下調(diào)ABCC4的表達可使人胰腺癌細胞的增殖得到明顯抑制，與文獻報道一致[6-7]。

但ABCC4基因的表達在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中所起的促增殖作用的具體分子機制目前還不是十分明確，這需要進一步的實驗研究予以探討和證實。

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EffectofABCC4genesilencingoncellproliferationandcellcycleinhumanpancreaticcancercelllinesPANC1andBxPC-3

MAJin,ZHANGZhou,WANGJian-cheng.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospitalLuwanBranch,ShanghaiJiao-TongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200020,China

Correspondingauthor:WANGJian-cheng,Email:jiancheng_wang@hotmail.com

ObjectiveTo determine the effect of ABCC4 gene silencing on cell proliferation and cell cycle in human pancreatic cancer cell lines PANC1 and BxPC-3.MethodsPANC1 and BxPC-3 pancreatic cancer cells were transfected with a lentivirus expressing an ABCC4 short hairpin RNA (shRNA). ABCC4 mRNA and protein expression of transfected cells was determined by RT-PCR and Western blot, colony formation ability was measured by colony assay, and cell cycle change was investigated by the flow cytometric analysis.ResultsLentivirus expressing an ABCC4 short hairpin RNA (shRNA) was successfully established. After transfection with shRNA lentivirus, ABCC4 mRNA and protein expression were significantly inhibited (0.28±0.01vs1.00±0.03, 0.22±0.02vs1.00±0.03,P<0.05). Colony formation ability was significantly decreased (4vs65,P<0.05), and cell cycle was significantly blocked at G1phase [(54.98±1.78)%vs(42.93±0.88)%, (68.55±0.75)%vs(54.76±0.29)%].ConclusionsABCC4 gene silencing can significantly inhibit cell proliferation of human pancreatic cancer cell lines PANC1 and BxPC-3, and block the cells at G1phase.

Pancreatic neoplasms; ABCC4; Cell, proliferation; RNA interference; Lentivirus infections

2012-12-12)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.011

200020 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院消化內(nèi)科(馬瑾)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科(張卓、王建承)

王建承，Email: jiancheng_wang@hotmail.com