重組大腸桿菌表達(dá)雙功能谷胱甘肽合成酶的發(fā)酵工藝研究

張 松，王德正，李 娓，李志敏，葉 勤

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種具有多種重要生理功能的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成。GSH在維持體內(nèi)氧化還原平衡、迅速增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)消化系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)機(jī)能、抗腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用[1］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、體育運(yùn)動(dòng)等領(lǐng)域。GSH的生物合成分為兩步[2］：第一步，谷氨酸的γ－羧基與半胱氨酸的氨基在γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHⅠ，即γ－GCS）的作用下催化形成肽鍵，合成γ－谷氨酰半胱氨酸；第二步，在谷胱甘肽合成酶（GSHⅡ，即GS）的作用下與甘氨酸反應(yīng)生成谷胱甘肽。其中GSHⅠ是谷胱甘肽合成的限速酶，受到還原型谷胱甘肽的反饋抑制[3］，而谷胱甘肽對(duì)GSHⅡ沒(méi)有反饋抑制[4］。

最近研究報(bào)道，除了GSHⅠ和GSHⅡ外，在某些菌[5，6］（如無(wú)乳鏈球菌、李斯特氏菌）中還存在另外一種特殊的雙功能谷胱甘肽合成酶（GshF），同時(shí)具有GSHⅠ和GSHⅡ的活性，對(duì)產(chǎn)物抑制不敏感，在谷胱甘肽生物合成中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。目前的研究主要集中在新酶的開(kāi)發(fā)和分子機(jī)制方面，未涉及發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)GshF的工藝優(yōu)化。

作者在此以重組表達(dá)嗜熱鏈球菌gshF基因的大腸桿菌BL21為對(duì)象，進(jìn)行了重組菌BL21／pET－gshF 5L罐的發(fā)酵研究，分別考察了不同培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑種類(lèi)、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、補(bǔ)料流加碳源類(lèi)型等因素對(duì)菌體生長(zhǎng)、GshF蛋白表達(dá)及其酶活的影響，擬為GshF在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

重組大腸桿菌BL21／pET－gshF，自行構(gòu)建；目的基因片段gshF來(lái)自嗜熱鏈球菌。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：含30mg·L－1卡那霉素的LB培養(yǎng)基。

基本 培 養(yǎng) 基 （g·L－1）：Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43，NH4Cl 3，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，酵母提取物5。葡萄糖5，115℃單獨(dú)滅菌30min；CaCl20.011，單獨(dú)滅菌。1%維生素B1用微孔濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌冷卻后按0.12mL·L－1的比例加入。微量元素混合溶液（μmol·L－1，F(xiàn)eCl350，CaCl220，MnCl2·4H2O 10，ZnSO4·7H2O 10，CoCl2·6H2O 2，CuCl2·2H2O 2，NiCl2·6H2O 2，Na2MoO4·5H2O 2，Na2SeO3·5H2O 2，H3BO32）用微孔濾膜（0.22μm）過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌冷卻后按0.12mL·L－1的比例加入。

補(bǔ)料培養(yǎng)基Ⅰ（g·L－1）：葡萄糖500，MgSO4·7H2O 25。

補(bǔ)料培養(yǎng)基Ⅱ（g·L－1）：甘油250，MgSO4·7H2O 25。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO47.1，KH2PO46.8，（NH4）2SO46.6，MgSO40.12，甘油20，葡萄糖0.5，乳糖2，琥珀酸鈉4.05，按0.12mL·L－1的比例加入微量元素儲(chǔ)備液。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

一級(jí)種子培養(yǎng)：將－20℃保存的甘油管菌株接種到裝有30mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加卡那霉素至終濃度為30mg·L－1，于37℃、220r·min－1培養(yǎng)6h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：將上述種子液按1%接種量接種到裝有125mL LB培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，于37℃、220r·min－1培養(yǎng)8h。

1.3.2 分批發(fā)酵

將二級(jí)種子液按5%接種量接種到裝有2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐（BIOTECH－BG－5型，上海保興生物設(shè)備公司）中，于37℃進(jìn)行分批發(fā)酵。用NaOH控制pH值為7.0左右，通氣量為1VVm，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速控制溶氧在30%以上。

1.3.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵

發(fā)酵罐裝液量為2.5L，接種量為5%，用25%氨水控制pH值為7.0，通氣量為1VVm，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速保持溶氧在30%以上。初糖耗盡、溶氧跳升后通過(guò)指數(shù)流加（控制比生長(zhǎng)速率0.3h－1）進(jìn)行補(bǔ)料，分別以葡萄糖和甘油兩種不同碳源流加。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期及中后期補(bǔ)加IPTG或者乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.4 分析方法

1.4.1 還原型谷胱甘肽的含量測(cè)定

用HPLC法檢測(cè)GSH含量。使用C18色譜柱（4.6mm×150mm），流動(dòng)相為0.01mol·L－1Na2HPO4和0.05mol·L－1K2HPO4溶液（含0.01mol·L－1庚烷磺酸鈉，pH值3.0）。檢測(cè)時(shí)流動(dòng)相和甲醇按95∶5的比例進(jìn)柱，柱溫30℃，流速0.6mL·min－1。

1.4.2 GshF蛋白定量

按照分子克隆對(duì)發(fā)酵樣品進(jìn)行蛋白凝膠電泳，并以蛋白Marker和牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)確定目標(biāo)蛋白GshF的大小和含量[7］。

1.4.3 酶活分析

取1mL菌液，離心收集菌體，加pH值為8.5的0.15mmol·L－1Tris－HCl、0.2mmol·L－1EDTA，0.1mmol·L－1KCl至1mL，在冰浴中超聲破碎后，于12 000r·min－1離心10min；取上清液500μL，加入40mmol·L－1Glu、40mmol·L－1Gly、20mmol·L－1Cys、40mmol·L－1MgCl2、40mmol·L－1ATP，30℃反應(yīng)30min；加入與反應(yīng)液等體積的20%三氯乙酸終止反應(yīng)，然后用HPLC檢測(cè)生成的GSH含量。

酶活單位（U）為：每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1mg GSH的酶量。

比酶活（U·g－1）為：每克GshF蛋白每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1mg GSH的酶量。

1.4.4 菌體密度的測(cè)定

將待測(cè)發(fā)酵液稀釋至一定濃度后，用紫外分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定發(fā)酵液的吸光度值。發(fā)酵液的細(xì)胞密度即為吸光度值與稀釋倍數(shù)的乘積。

1.4.5 其它物質(zhì)的測(cè)定

葡萄糖、甘油、乙酸、乳糖、琥珀酸的含量均采用HPLC法檢測(cè)[8］。色譜柱為 Aminex HPX－87H，用紫外檢測(cè)器和視差折光檢測(cè)器檢測(cè)；流動(dòng)相為5mmol·L－1H2SO4，流速0.6mL·min－1，檢測(cè)溫度65℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 自誘導(dǎo)培養(yǎng)基分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方式，可以初步獲得菌體生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)的基本規(guī)律，為后續(xù)優(yōu)化提供借鑒，但分批培養(yǎng)后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)和蛋白的高表達(dá)。Studier[9］在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌，目標(biāo)蛋白得到很好的表達(dá)。因此，本研究首先考察37℃時(shí)使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng)時(shí)的菌體生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和GshF蛋白表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 分批培養(yǎng)時(shí)菌體生長(zhǎng)、代謝情況和GshF表達(dá)量Fig.1 The cell growth，metabolism and GshF expression in batch culture

由圖1可見(jiàn)，在37℃自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，前8h菌體生長(zhǎng)迅速，乙酸積累了1.9g·L－1；培養(yǎng)10h時(shí)甘油耗盡，OD600達(dá)到最大值18.5，并開(kāi)始利用積累的乙酸，菌體生長(zhǎng)基本停滯；培養(yǎng)10h時(shí)GshF表達(dá)量達(dá)到最大值0.26g·L－1，隨后隨著菌體濃度的減小，出現(xiàn)下降；初始葡萄糖只有0.5g·L－1，因此很快就被完全消耗，過(guò)程中基本檢測(cè)不到。

2.2 以葡萄糖為碳源流加實(shí)驗(yàn)

補(bǔ)料流加培養(yǎng)是生產(chǎn)重組蛋白最常用的方式，能使基質(zhì)濃度保持在較低水平，有效地抑制副產(chǎn)物的積累，提高外源蛋白的表達(dá)效率。由于自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使用了較多的復(fù)合成分，增加了生產(chǎn)成本，因此補(bǔ)料流加工藝以添加少量復(fù)合成分的基本培養(yǎng)基（添加酵母提取物的M9培養(yǎng)基）為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，考察IPTG誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、乳糖作為碳源和誘導(dǎo)劑時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響。

2.2.1 IPTG誘導(dǎo)溫度的影響

采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基在37℃下進(jìn)行菌體培養(yǎng)，4.8h開(kāi)始控制比生長(zhǎng)速率為0.3h－1，指數(shù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基Ⅰ，10.5h添加0.5mmol·L－1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，比較誘導(dǎo)溫度為37℃、30℃時(shí)的菌體生長(zhǎng)和GshF表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 IPTG誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)、GshF表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of induction temperature on cell growth，GshF expression

以添加酵母提取物的M9培養(yǎng)基為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，并限制性流加葡萄糖的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中未檢測(cè)到殘余葡萄糖和乙酸生成。由圖2可見(jiàn)，37℃進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，GshF表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，比酶活最大達(dá)到74.6U·g－1；30℃誘導(dǎo)時(shí)，比酶活最大為70.9U·g－1。表明，誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和GshF的表達(dá)影響不大。

2.2.2 IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

考慮到過(guò)早誘導(dǎo)可能增加表達(dá)外源蛋白的代謝負(fù)荷而抑制菌體生長(zhǎng)，從而影響GshF表達(dá)量。因此嘗試推遲誘導(dǎo)劑添加時(shí)間，在OD600達(dá)到50的時(shí)候加入0.5mmol·L－1IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加IPTG誘導(dǎo)后，菌體在最初的2h內(nèi)保持高速指數(shù)生長(zhǎng)，之后生長(zhǎng)速率減慢，OD600在18h達(dá)到最大值96.8，但GshF表達(dá)量最高只有2.13g·L－1（表1 ）。表明推遲誘導(dǎo)劑添加時(shí)間雖然有利于菌體生長(zhǎng)，但GshF表達(dá)量并沒(méi)有顯著提高。

表1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長(zhǎng)、GshF表達(dá)量的影響Tab.1 Effect of induction time on cell growth，GshF expression

2.2.3 乳糖誘導(dǎo)的影響

維持初始發(fā)酵培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基不變，在9h OD600達(dá)到33時(shí)停止流加葡萄糖以防止葡萄糖對(duì)乳糖誘導(dǎo)的抑制作用，饑餓處理0.5h至葡萄糖完全耗盡，然后恒速（40mL·h－1）流加20%乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乳糖誘導(dǎo)對(duì)菌體生長(zhǎng)、GshF表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of induction by lactose on cell growth，GshF expression

由圖3可見(jiàn)，雖然乳糖既有誘導(dǎo)作用，又能作為碳源被菌體代謝，但作為碳源，和葡萄糖相比還是難以利用，菌體生長(zhǎng)幾乎停止；GshF表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到IPTG誘導(dǎo)的效果，最高值僅為0.19g·L－1。這可能是因?yàn)?，乳糖只有借助于乳糖透酶的作用進(jìn)入到菌體細(xì)胞內(nèi)，并經(jīng)過(guò)β－乳糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為異乳糖才會(huì)起到誘導(dǎo)劑的作用[10］。雖然乳糖誘導(dǎo)的GshF表達(dá)量低，但其比酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于IPTG誘導(dǎo)時(shí)的比酶活，在誘導(dǎo)3h時(shí)達(dá)到最大值359U·g－1，即出現(xiàn)了蛋白含量低、酶活高的現(xiàn)象[11］。原因可能是IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生GshF較乳糖快，使得蛋白來(lái)不及正確折疊，從而形成了部分包涵體，導(dǎo)致酶活較低。

2.3 以甘油為碳源流加實(shí)驗(yàn)

葡萄糖作為一種很容易被菌體利用的碳源，能使菌體短時(shí)間內(nèi)大量增殖，但過(guò)快的生長(zhǎng)速度并不利于外源蛋白的表達(dá)，而且葡萄糖過(guò)量也容易引起乙酸等代謝物的積累，這對(duì)蛋白表達(dá)也是不利的。甘油是一種較慢被大腸桿菌利用的碳源，進(jìn)行甘油補(bǔ)料流加不僅產(chǎn)生較少的副產(chǎn)物乙酸，而且可以實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵，因此初步嘗試在生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段均流加20%的甘油，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 誘導(dǎo)前后均流加甘油時(shí)的菌體生長(zhǎng)、GshF表達(dá)量Fig.4 Cell growth，GshF expression with glycerol fed before and after induction

由圖4可見(jiàn)，流加甘油，OD600最終達(dá)到34.3；在OD600為20時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)，GshF表達(dá)量在誘導(dǎo)3h后達(dá)到最大值1.83g·L－1，隨后出現(xiàn)波動(dòng)降低。這一方面是由于發(fā)酵液中蛋白酶的作用，也與后期菌濃不再增加有關(guān)。甘油流加工藝中GshF表達(dá)量稍低于葡萄糖流加工藝，且后期菌濃停止增加，不利于繼續(xù)提高蛋白表達(dá)和保持蛋白活性。

3 結(jié)論

在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組大腸桿菌BL21／pET－gshF，考察了不同培養(yǎng)基、誘導(dǎo)方式和流加碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)、GshF蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明：

（1）使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基分批發(fā)酵，能夠代替添加IPTG實(shí)現(xiàn)GshF蛋白的自發(fā)誘導(dǎo)，但表達(dá)量較低，培養(yǎng)基成本過(guò)高。

（2）以M9培養(yǎng)基加5g·L－1酵母提取物為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖作為流加碳源并在OD600達(dá)到30時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和GshF表達(dá)量影響均不大；推遲IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)，菌體生長(zhǎng)量大幅提高，但GshF表達(dá)量并沒(méi)有顯著提高；在使用乳糖作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，GshF表達(dá)量較低，但比酶活高于IPTG誘導(dǎo)。乳糖成本低，需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝使其能在保持高酶活的前提下提高蛋白表達(dá)量。

（3）以甘油為碳源進(jìn)行流加培養(yǎng)和蛋白表達(dá)，也實(shí)現(xiàn)了GshF的高效表達(dá)，但后期菌體生長(zhǎng)停滯，蛋白降解嚴(yán)重，因此甘油作為碳源工藝條件還不成熟，需要進(jìn)一步探索。

[1]錢(qián)小明，吳學(xué)豪.還原型谷胱甘肽在急危重癥中的應(yīng)用[J］.中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2003，23（6）：411－412.

[2]Blach K C.The synthesis of glutathione in isolated liver[J］.Biol Chem，1949，179（3）：1245－1254.

[3]Ikner A，Shiozaki K.Yeast signaling pathways in the oxidative stress response[J］.Mutat Res，2005，569（1－2）：13－27.

[4]毛珍，裘娟萍.酵母菌中谷胱甘肽的主要生理功能及其代謝調(diào)控[J］.微生物學(xué)雜志，2005，25（1）：94－96.

[5]Janowiak B E，Griffith O W.Glutathione synthesis in Streptococcus agalactiae.One protein accounts for gamma－glutamylcysteine synthetase and glutathione synthetase activities[J］.J Biol Chem，2005，280（12）：11829－11839.

[6]Gopal S，Borovok I，Ofer A，et al.A multidomain fusion protein in Listeria monocytogenes catalyzes the two primary activities for glutathione biosynthesis[J］.J Bacteriol，2005，187（11）：3839－3847.

[7]鄧永康，吳民瀘，劉盛邦，等.乳糖誘導(dǎo)重組尿酸酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)[J］.中國(guó)生物工程雜志，2009，29（7）：74－79.

[8]Liu Y，Wu H，Li Q，et al.Process development of succinic acid production by Escherichia coli NZN111using acetate as an aerobic carbon source[J］.Enzyme and Microbial Technology，2011，49（5）：459－464.

[9]Studier F W.Protein production by auto－induction in high density shaking cultures[J］.Protein Expression and Purification，2005，41（1）：207－234.

[10]楊書(shū)慧，趙勝軍，劉軍，等.乳糖誘導(dǎo)甜蛋白Monellin在大腸桿菌中的表達(dá)[J］.中國(guó)生物工程雜志，2008，28（3）：53－58.

[11]余永恒，李清雄，王革非.乳糖誘導(dǎo)重組人睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2007，20（1）：43－46.