酸奶中桿菌和球菌的快速分離及發(fā)酵劑的制備

付 鴻，李靖靖，岳 春

（1.中州大學(xué)化工食品學(xué)院，河南 鄭州450044；2.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽473004）

近年來，隨著人民生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，我國發(fā)酵酸乳制品工業(yè)迅猛發(fā)展[1］。酸奶以其獨(dú)特的風(fēng)味和特有的保健功能越來越受到人們的喜愛，其產(chǎn)量正以每年25%的速度遞增[2］，這對(duì)酸奶發(fā)酵劑的品質(zhì)、特性、種類提出了新的要求。目前，我國酸奶發(fā)酵劑的制備大多停留在傳統(tǒng)人工型發(fā)酵劑水平上，一般需要配備專門菌種室、專業(yè)人員、專用設(shè)備，存在工序多、周期長、菌種容易污染和退化等缺點(diǎn)，導(dǎo)致酸奶質(zhì)量不穩(wěn)定，影響了企業(yè)的信譽(yù)和酸奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3］。

要獲得良好的酸乳制品，其發(fā)酵菌種中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例一般應(yīng)為（1～2）∶1，但由于兩者的生長要求和耐酸能力不同，在繼代培養(yǎng)后兩者的比例會(huì)發(fā)生變化，若干代后的菌種便不能用于生產(chǎn)，有些甚至產(chǎn)生雜菌，給酸奶的風(fēng)味帶來很大的影響。為此，作者利用這兩種菌不同的生長特性，先將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌分離，再按（1～2）∶1的比例混合培養(yǎng)后用于制備酸奶發(fā)酵劑，可有效地解決這一問題。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與儀器

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌（生產(chǎn)發(fā)酵劑），由三色鴿乳業(yè)提供。

鹽酸、NaOH、葡萄糖、酵母膏、溴甲酚綠、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純；脫脂乳粉、乳粉水解液，均為食品級(jí)。

YQX型厭氧培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋等。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental process

1.2.1 乳酸菌混合菌種的活化

按1∶7（質(zhì)量體積比）的比例將脫脂乳粉和水配成復(fù)原牛奶600mL，加入15g蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～15min，然后冷卻至40℃，在無菌操作下，等量裝入3個(gè)250mL的錐形瓶中，接入5%的乳酸菌混合菌種，置于42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，取出，連續(xù)活化兩代后備用。

1.2.2 乳酸菌混合菌的分離[4，5］

乳酸菌混合菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，蕃茄汁20%，吐溫－80 0.05%，CaCO32g，瓊脂2g，蒸餾水100mL，pH 值6.5，于121℃滅菌20min，備用。

取活化乳酸菌混合菌種1mL加入到9mL無菌水中，依次用10倍法稀釋至10－6；取各個(gè)稀釋度菌液1mL與已滅菌的培養(yǎng)基制成混合平板；將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養(yǎng)2～3d，挑選單個(gè)菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，用無菌玻璃刮鏟依次涂布，或直接用接種環(huán)沾取原液，平板劃線分離，于40℃培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的淡黃色菌落且其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者，可初步定為乳酸菌。反復(fù)進(jìn)行3～5次純化，通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷乳酸菌純度，待確認(rèn)為純種后，再進(jìn)行鑒定、保存。

1.2.3 保加利亞乳桿菌的分離與鑒定

將BCP培養(yǎng)基的pH值用1%的鹽酸調(diào)至5.0，于121℃滅菌20min；無菌條件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌種劃平板，將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養(yǎng)48h，反復(fù)進(jìn)行3～5次純化，通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷保加利亞乳桿菌純度，待確認(rèn)為純種后，再進(jìn)行鑒定。

1.2.4 嗜熱鏈球菌的分離與鑒定

將BCP培養(yǎng)基的pH值用1%的NaOH調(diào)至9.0，于121℃滅菌20min，無菌條件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌種劃平板，將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養(yǎng)48h，反復(fù)進(jìn)行3～5次純化，通過檢查繼代培養(yǎng)中長出的所有菌落形態(tài)是否一致判斷嗜熱鏈球菌純度，待確認(rèn)為純種后，再進(jìn)行鑒定。

1.2.5 酸奶混合菌種的制備

1.2.5.1 乳酸菌種的活化與計(jì)數(shù)

活化培養(yǎng)基：脫脂乳粉13%，葡萄糖2%，乳粉水解液4%，酵母浸膏0.25%，溶劑為0.025mol·L－1NaH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液（pH＝6.8）。

選擇性培養(yǎng)基主要用于單菌分離，并非最適合生長培基。分別將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在活化培養(yǎng)基上于42℃活化6h，采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算酸乳中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量。

1.2.5.2 液體菌種的混合

取1mL桿菌活化液和12.5mL球菌活化液，混合，作為酸奶混合菌種。

1.2.6 酸奶發(fā)酵劑的制備

1.2.6.1 種子發(fā)酵劑的制備

培養(yǎng)基：5mL 5%的石蕊液加入100mL脫脂乳（脫脂乳粉與5%蔗糖水以1∶10比例配制）移至250mL的三角瓶中。于121℃、0.15MPa滅菌20min。

接種：在石蕊牛乳上接1mL酸奶混合菌種于42℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至液面呈紅色。

1.2.6.2 母發(fā)酵劑的制備

在250mL三角瓶中加入150mL脫脂乳（按1∶7的比例將脫脂乳粉和水配成復(fù)原牛奶，然后加入4g蔗糖）于121℃、0.15MPa滅菌20min，冷卻后用已滅菌的吸管吸取1mL凝塊，放入三角燒瓶中，攪拌后于42℃培養(yǎng)至酸度達(dá)0.8%～1.0%。

1.2.6.3 工作發(fā)酵劑的制備

將新鮮牛乳于90～95℃ 巴氏殺菌30～60min，冷卻至42～45℃，無菌條件下接種2%母發(fā)酵劑，培養(yǎng)4～6h，冷卻后熟即得菌種。

將新鮮牛奶過濾，于95℃巴氏殺菌10min，冷卻至45℃，接種3%的上一步菌種，發(fā)酵4h，后熟12h，即得工作發(fā)酵劑。經(jīng)測(cè)定，其活力為0.85%。

1.3 分析檢測(cè)

1.3.1 活力測(cè)定[6］

活力檢查：使用前在化驗(yàn)室對(duì)發(fā)酵劑的活力進(jìn)行檢查，依據(jù)發(fā)酵劑的酸生成狀況或色素還原情況進(jìn)行判斷（好的酸乳發(fā)酵劑活力一般在0.8%以上）。

活力測(cè)定：在滅菌冷卻后的脫脂乳中加入3%的發(fā)酵劑，于37.8℃恒溫箱中培養(yǎng)3.5h，測(cè)定酸度，若滴定乳酸度達(dá)0.8%以上，認(rèn)為活力良好。

1.3.2 乳酸菌計(jì)數(shù)

采用血球板計(jì)數(shù)法[4］計(jì)算乳酸菌。

1.3.3 乳酸菌的鏡檢[4，7］

采用特殊的染色法——甲苯胺藍(lán)染色法，即涂片固定后，用0.2%的甲苯胺藍(lán)染色液染色2min，再用1%的乙酸溶液脫色數(shù)秒，即可使涂片中的菌體著染藍(lán)色，而且背景呈現(xiàn)白色或無色，菌體形狀十分清晰，即使涂片很厚且不勻也能看清菌體，便于菌體細(xì)胞計(jì)數(shù)和形體觀察。通過甲苯胺藍(lán)染色觀察分離培養(yǎng)的乳酸菌，根據(jù)乳酸菌的性質(zhì)，看是否有其它雜菌，若有，挑取變?yōu)辄S色的菌落，繼續(xù)劃平板培養(yǎng)，直到鏡檢全是乳酸菌為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基pH值的確定

由于保加利亞乳桿菌在pH值為5或更低的情況下可生長、嗜熱鏈球菌在pH值較低的情況下不生長，為了確定乳桿菌能生長而鏈球菌不能生長的合適pH值，以保加利亞乳桿菌革蘭氏染色的鏡檢結(jié)果及菌落生長狀況為指標(biāo)進(jìn)行pH值單因素實(shí)驗(yàn)。挑取分離得到的乳酸菌菌落，接種到保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基中，于42℃厭氧培箱中培養(yǎng)48h，用革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢，結(jié)果見表1 。

表1 保加利亞乳桿菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Tab.1 Microscopic examination results of Gram－staining for Lactobacillus bulgaricus

由表1 可以看出，保加利亞乳桿菌分離培養(yǎng)基的pH值為5.0時(shí)，分離效果最佳。

2.2 保加利亞乳桿菌性質(zhì)鑒定

保加利亞乳桿菌菌落特征為：菌落呈中等大小，微白色，濕潤，邊緣不整齊，如棉絮團(tuán)狀。屬革蘭氏陽性桿菌，菌體寬度小于2μm，常表現(xiàn)出長桿狀，多呈線狀，常有卷曲，幼齡時(shí)單個(gè)或成對(duì)。符合文獻(xiàn)[8］對(duì)保加利亞乳桿菌形態(tài)的描述。

將鑒定過的保加利亞乳桿菌接種到脫脂乳中，于不同溫度下培養(yǎng)發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌在39～44℃時(shí)約4h凝乳；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過44℃時(shí)，隨著溫度的升高，凝乳時(shí)間延長；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過53℃時(shí)，不能凝乳；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于39℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的降低，凝乳時(shí)間延長；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于23℃時(shí)，不能凝乳。

分離到的桿菌在含膽汁酸鹽的液體培養(yǎng)基、含2%氯化鈉的液體培養(yǎng)基、含0.4%酚的培養(yǎng)基中均能生長，而在含0.5%酚的培養(yǎng)基中不能生長。進(jìn)一步證明，分離到的桿菌是保加利亞乳桿菌。

2.3 嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基pH值的確定

由于嗜熱鏈球菌在pH值為9.2的情況下能生長、保加利亞乳桿菌在pH值較高的情況下不生長，為了確定嗜熱鏈球菌能生長而保加利亞乳桿菌不能生長的合適pH值，以嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果及菌落生長狀況為指標(biāo)進(jìn)行pH值單因素實(shí)驗(yàn)。挑取分離得到的乳酸菌菌落，接種到嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基中，于42℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢，結(jié)果見表2 。

表2 嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Tab.2 Microscopic examination results of Gram－staining of Streptococcus thermothillus

由表2 可以看出，嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基的pH值為9.0時(shí)，分離效果最佳。

2.4 嗜熱鏈球菌性質(zhì)鑒定

嗜熱鏈球菌菌落特征為：菌落光滑，微白色，邊緣整齊。屬革蘭氏陽性球菌，黃色，菌落較大，生長良好，菌落卵圓形，表面光滑，凸起，符合文獻(xiàn)[8］對(duì)嗜熱鏈球菌形態(tài)的描述。

將分離得到的嗜熱鏈球菌接種到脫脂乳中，于不同溫度下培養(yǎng)發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌在39～46℃時(shí)約4h凝乳；在46～50℃時(shí)，隨著溫度的升高，凝乳時(shí)間延長；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過54℃時(shí)，不能凝乳；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于39℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的降低，凝乳時(shí)間延長；當(dāng)培養(yǎng)溫度低于21℃時(shí)，不能凝乳。

分離到的球菌在含2%氯化鈉的液體培養(yǎng)基、0.1%的鎂藍(lán)牛乳中不能生長。進(jìn)一步證明，分離到的球菌是嗜熱鏈球菌。

2.5 乳酸單菌與混合菌發(fā)酵酸乳品的性質(zhì)比較（表3 ）

表3 乳酸單菌及混合菌發(fā)酵的酸乳品性質(zhì)比較Tab.3 Performance comparison of yogurts fermented by Lactobacillus bulgaricus，Streptococcus thermothillus or their mixture

由表3 可知，乳酸單菌發(fā)酵效果沒有球桿混合菌的效果好。

2.6 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌配比的確定

分別取活化后的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌1mL，用無菌水進(jìn)行10倍法均勻稀釋，取10－6、10－7、10－83種稀釋度，用混合平板法培養(yǎng)，凝固后于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見表4。

由表4可以看出，1mL活化菌懸液中，保加利亞乳桿菌的數(shù)量是嗜熱鏈球菌數(shù)量的25倍，因此在制發(fā)酵劑時(shí)，可以取1mL桿菌活化液和25mL或12.5mL球菌活化液進(jìn)行混合，這樣混合制得的發(fā)酵劑中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例可以控制在（1～2）∶1之間。

表4 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的平板計(jì)數(shù)結(jié)果Tab.4 Count results of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermothillus

2.7 工作發(fā)酵劑接種量的確定（表5 ）

表5 工作發(fā)酵劑接種量的確定Tab.5 Choose of inoculum amount of fermentation agent

由表5 可以看出，工作發(fā)酵劑接種量以3%為佳，可以制得酸味適中、香味濃郁的酸乳制品。

3 結(jié) 論

（1）利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適pH值不同，確定了當(dāng)BCP培養(yǎng)基的pH值分別為5.0和9.0時(shí)，能將兩者有效分離。

（2）將分離開來的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按（1～2）∶1的比例混合制得酸奶發(fā)酵劑，以其作為乳酸菌菌種制得的酸乳品酸味適中、香味濃郁。

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