幾種江蘺屬海藻3個分子序列的系統(tǒng)學(xué)分析

趙小波 , 逄少軍 劉 峰

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

江蘺屬(Gracilaria)海藻在自然分類上隸屬于紅藻門(Rhodophyta), 江蘺目(Gracilariales), 江蘺科(Gracilariaceae), 廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶海域, 是世界范圍內(nèi)十分重要的經(jīng)濟(jì)海藻[1]。江蘺屬中栽培的物種主要是龍須菜、細(xì)基江蘺、脆江蘺, 還有智利的智利江蘺。龍須菜栽培主要在我國廣東、福建、山東沿海, 其主要用途是提取瓊膠、鮑魚餌料、食用等。江蘺屬內(nèi)其他物種也是重要的食品以及工業(yè)原料。因此, 江蘺屬海藻產(chǎn)業(yè)市場發(fā)展?jié)摿Υ蟆Ｄ壳? 江蘺屬海藻的研究還存在一些問題: 由于缺乏足夠的證據(jù), 這些海藻之間復(fù)雜的分類關(guān)系尚未完全厘清[2], 例如傳統(tǒng)分類學(xué)家將龍須菜歸入江蘺屬[3],但是許多分子生物學(xué)證據(jù)認(rèn)為龍須菜并不隸屬于江蘺屬[2,4-5]; 雖然分子生物學(xué)手段越來越多的被應(yīng)用于江蘺屬系統(tǒng)分類研究之中, 但大多數(shù)研究局限于ITS以及rbcL序列, 且研究結(jié)果存在差異[4-9]; 此外,雖然分子系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展迅速, 但是一個可信度較高的系統(tǒng)分類結(jié)果對于系統(tǒng)分類學(xué)家來說仍然是困難的。單純憑借一個DNA序列進(jìn)行分析, 往往會由于進(jìn)化速率不同等因素導(dǎo)致在不同的研究中得出完全不同甚至是錯誤的結(jié)論。為了更清楚的了解中國科學(xué)院海藻種質(zhì)庫活體保存的不同江蘺屬海藻物種在分類進(jìn)化上的關(guān)系, 作者利用核基因編碼的18S rRNA基因、位于線粒體的cox2-3間隔區(qū)、以及位于葉綠體的RUBISCO間隔區(qū)研究了來自不同地區(qū)的5個物種, 并與GenBank中已知相關(guān)序列進(jìn)行比對分析, 力圖從分子水平上闡明江蘺屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為江蘺屬的系統(tǒng)進(jìn)化、種質(zhì)鑒定等提供新的佐證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用江蘺屬、Gracilariopsis屬樣品采集自我國不同海區(qū)(表1)。所有樣品首先依照形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類鑒定[3,10-11], 在提取DNA之前, 將藻體用消毒海水清洗, 活體保存于中國科學(xué)院海洋研究所海藻種質(zhì)庫。

1.2 總DNA提取與PCR擴(kuò)增

總DNA提取參考Goff[12]的方法, 并對部分細(xì)節(jié)進(jìn)行了改動。將藻體用消毒海水清洗干凈之后, 取0.1g于液氮中充分研磨后, 加入大約2mL提取緩沖液[4% SDS, 0. 05 mol/ LTris. HCl, 0. 1 mol/ L EDTA,0.2 mol/ L NaCl], 加蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL,然后震蕩3～4h (50 ℃ ), 12000 r/min 離心10 min, 取上清后加等體積的酚抽提, 12000r/min離心10min取上清, 再以酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)及氯仿抽提,12000r/min離心10min取上清。上清液加入2倍的無水乙醇和1/10體積的醋酸鉀離心, 70%乙醇洗滌2次, 干燥后, 溶解在50μL無菌三蒸水儲存?zhèn)溆?。采所提取DNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。使用PCR技術(shù)[13]擴(kuò)增18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)序列。用于18S rRNA序列擴(kuò)增的引物為: 18SF 5-CAACCTG GTTGATCCTGCCAGT-3; 18SR 5-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)處理5 min后, 94 ℃變性1min, 60℃復(fù)性2min, 72℃延伸4min, 總35個循環(huán), 最后在72℃延伸7min, 4℃保存[2]。cox2-3間隔區(qū)擴(kuò)增引物為: coxF 5-GTACCWTCTTTDRGRRK DAAAT GTGATGC-3;coxR 5-GGATCTACWAGATGRAAWGGATGTC-3。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)處理4 min后, 93 ℃變性1min,45℃復(fù)性1min, 72℃延伸1min, 總5個循環(huán), 然后93℃變性30s, 55℃復(fù)性30s, 72℃延伸30s, 總30個循環(huán)。最后在72℃延伸5min, 4℃保存[14]。RUBISCO間隔區(qū)序列擴(kuò)增引物為: rbcF 5-TATACTTCTACAGACACAGCTGA-3; rbcR 5-ATGTCAAATAATGGTAGT CCCCA-3。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)處理4 min后, 93 ℃變性1min, 45℃復(fù)性1min, 72℃延伸1min, 總5個循環(huán), 然后93℃變性1min, 55℃復(fù)性1min, 72℃延伸1min, 總30個循環(huán)。最后在72℃延伸5min, 4℃保存[15]。

PCR反應(yīng)體系20μL包括: 10×PCR反應(yīng)緩沖液,MgCl2(25mmolL-1)1.5μL, dNTPs (2.5 mmolL-1)2μL,Taq (5UμL-1)0.2μL, 引物 (10 mmolL-1)0.5μL,ddH2O 12.3μL。所有PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司(Takara, Dalian)。

PCR產(chǎn)物用UNIQ-10 PCR Purification Kit試劑盒(上海生工)膠回收純化。純化產(chǎn)品與pMD19-T載體(大連寶生物工程有限公司)連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coliTOP 10(北京全是金生化科技有限公司)中, 經(jīng)氨芐青霉素(AMP)抗性篩選后, 隨機(jī)挑取5個陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 菌液PCR擴(kuò)增預(yù)檢測插入片段大小, 委托上海生工進(jìn)行雙向測序。所得PCR產(chǎn)品序列上傳至GenBank。

表1 樣品采集信息Tab.1 Information of algal samples

1.3 數(shù)據(jù)分析

序列數(shù)據(jù)首先利用BLAST與GenBank中已有序列信息進(jìn)行比對。然后利用ClustalW軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行人工對齊排序。用MEGA 5.0計算其堿基含量和變異位點, 并選擇Kimura 2-parameter公式[16]計算遺傳距離。并在MEGA5.0中采用最大簡約法(Maximum parsimony, MP)構(gòu)建系統(tǒng)樹, 自舉值Bootstrap為1000次重復(fù)。保留大于60的Bootstrap數(shù)值。選擇線形紫菜(Porphyra linearisGreville)作為外群。

2 結(jié)果

2.1 18S rRNA序列分析結(jié)果

所有樣品擴(kuò)增條帶去除引物后, 序列長度一致,均為1722bp。江蘺屬海藻不同樣品堿基頻率一致, 均為A: 25.1%; T: 25.9%; G: 28.3%; C: 20.7%。龍須菜堿基頻率與江蘺屬略有不同A: 25.1%; T: 25.5%; G:28.5%; C: 20.9%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為1.42。江蘺屬種間遺傳距離為0.005～0.017, 共計61個變異位點; 江蘺屬與龍須菜物種間的遺傳距離在0.019～ 0.028 (表2), 共計90個變異位點。采自不同地區(qū)的龍須菜種內(nèi)遺傳距離為0.000, 變異位點為0個。與GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對之后序列長度為1699bp, 可分為2大分支, 包括龍須菜分支, 江蘺屬分支。其中, 脆江蘺Gracilaria chouae與扁江蘺G.textorii聚合, 形成分支Ⅰ; 真江蘺Gracilaria vermiculophylla形成分支Ⅱ;G. debilis,G. fergusonii, G.salicornia與G. foliifera聚合組成分支Ⅲ(圖1)。

表2 基于18S rRNA序列的樣品間遺傳距離Tab.2 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for 18S rRNA sequences of samples

圖1 樣品18S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using 18S rRNA sequence

2.2 COX2-3序列分析結(jié)果

目的片斷去除擴(kuò)增引物之后, 江蘺屬海藻大小為343bp, 片段堿基頻率略有不一, 平均GC含量為24.43%。龍須菜片段大小略長, 為347bp, GC含量為22.2%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為 1.32。江蘺屬海藻種間遺傳距離為 0.105～0.221, 共計 102個變異位點, 江蘺屬與龍須菜屬間的遺傳距離為0.196～0.244, 變異位點共計112個, 龍須菜群體內(nèi)遺傳距離為 0.000(表 3), 變異位點 0個。與 GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對之后長度為310bp。江蘺屬與龍須菜在系統(tǒng)樹上分為兩大分支, 龍須菜位于系統(tǒng)樹的最基部。江蘺屬中, 扁江蘺與脆江蘺聚成分支Ⅰ;真江蘺與細(xì)基江蘺繁殖變種,G. foliifera聚成分支Ⅱ;G. dura與G. debilis分別聚成分支Ⅲ(圖2)。

表3 基于cox2-3間隔區(qū)序列的樣品間遺傳距離Tab.3 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for cox2-3 intergenic spacer sequences of samples

圖2 樣品cox2-3間隔區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using cox2-3 intergenic spacer sequence

2.3 RUBISCO spacer序列分析結(jié)果

目的片段去除擴(kuò)增引物后, 江蘺屬海藻大小不一為 246～289bp, 平均 GC 含量為 49.7%; 龍須菜RUBISCO spacer序列長度為 289bp, GC含量為47.4%。江蘺屬樣品轉(zhuǎn)換/顛換比例(R)為 1.41。江蘺屬海藻種間遺傳距離為0.048～0.215, 共有78個變異位點; 江蘺屬與龍須菜之間的遺傳距離為0.190～0.259, 共計86個變異位點。龍須菜群體遺傳距離為0.000(表4), 變異位點0個。樣品與GenBank下載的數(shù)據(jù)人工比對后長度為237bp, 系統(tǒng)進(jìn)化樹有2大分支, 江蘺屬與龍須菜。江蘺屬分支由4個小分支組成。其中, 扁江蘺與脆江蘺聚成分支Ⅰ,G.salicornia與G. fergusonii分支Ⅱ、G. dura與G. debilis聚成分支Ⅲ, 真江蘺與細(xì)基江蘺繁殖變種聚成分支Ⅳ。G. gracilis處于江蘺屬分支的基部。龍須菜處于整個進(jìn)化樹的基部(圖3)。

表4 基于RUBISCO間隔區(qū)序列的樣品間遺傳距離Tab.4 Genetic distance calculated using Kimura 2-parameter model for RUBISCO spacer sequences of samples

圖3 樣品RUBISCO間隔區(qū)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Maximum-parsimony (MP)phylogeny estimated using RUBISCO spacer sequence

3 討論

歷史上, 關(guān)于龍須菜的分類地位一直存有爭議[17]。Papenfuss[18]認(rèn)為龍須菜隸屬江蘺屬, 我國2007年出版的《中國黃渤海海藻》一書仍然將龍須菜歸于江蘺屬[11]。但近10年來, 越來越多的分子生物學(xué)研究結(jié)果表明龍須菜并不隸屬于江蘺屬。在本研究中, 位于基因組不同位點的18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)3個序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明: 龍須菜位于進(jìn)化樹的基部, 單獨成支, 說明其與江蘺屬相比, 其分化較早, 相對原始; 并且龍須菜與江蘺屬海藻具有較遠(yuǎn)的遺傳距離。這些結(jié)果進(jìn)一步印證了Gurgel等人基于rbcL序列的研究結(jié)果[19]。他們認(rèn)為, 江蘺科的物種在進(jìn)化上是多起源的, 而龍須菜所在Gracilariopsis屬較早出現(xiàn)了分化, 逐步進(jìn)化成獨立于另外2個江蘺屬的單獨一支, 因此龍須菜不應(yīng)隸屬于江蘺屬。在本研究中, 扁江蘺與脆江蘺,G.dura與G. debilis在三個系統(tǒng)樹中均聚合成支, 顯示了它們之間具有較近的親緣關(guān)系。Pareek等[20]研究了印度沿海地區(qū)江蘺屬海藻系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 他們發(fā)現(xiàn)G.foliifera與G. corticata的兩個變種(var. corticata和cylindrica)具有很近的親緣關(guān)系;G. salicornia和G.fergusonii可能是由共同祖先進(jìn)化而來; 而G. gracilis與其他江蘺屬海藻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這一點, 在作者的結(jié)果中得到了證實,G. gracilis與其他樣品之間也具有明顯較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。G. gracilis處于江蘺屬分支的最底部, 說明其分化較早, 屬于江蘺屬內(nèi)較為原始的物種。

本研究結(jié)果顯示基于cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)的進(jìn)化樹有相似的關(guān)系, 但是與基于18S rRNA的進(jìn)化樹又略有不同。原因在于相對于cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)序列, 18S rRNA序列則更加保守。早在上世紀(jì)90年代, Bird[21-22]就發(fā)現(xiàn)18S rRNA序列不能在種水平區(qū)分江蘺科海藻, Bellorin[2]以及Iyer[4]均取得了類似結(jié)論。Medlin指出使用18S rRNA序列研究系統(tǒng)進(jìn)化具有一些缺陷: 對于親緣關(guān)系較近的物種的分辨度不足[23]。在作者的研究中也發(fā)現(xiàn)cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)的保守性要弱于18S rRNA序列, 能更好的反應(yīng)江蘺屬海藻的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

本實驗使用了18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)這3個序列, 而沒有采用ITS序列。原因在于: 第一, 之前已經(jīng)有相當(dāng)多的工作使用ITS序列研究江蘺科的海藻[5,9]; 第二, Saunders發(fā)現(xiàn)ITS序列在紅藻中具有一定的多態(tài)性問題[24]。雖然李敏等[9]認(rèn)為來自同一居群龍須菜個體的ITS序列相同,但是在作者之前的研究中擴(kuò)增江蘺屬真江蘺的ITS序列時確實遇到了這一問題[25], 因此如果使用ITS序列研究整個江蘺屬海藻, 有可能會對后續(xù)的工作造成不同程度的干擾。同時, 18S rRNA、cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)這3個序列尚未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性問題,這也是作者選擇這三個序列的原因之一。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展, 相關(guān)生物學(xué)數(shù)據(jù)的不斷積累, 利用DNA序列研究物種系統(tǒng)進(jìn)化, 已經(jīng)成為生物學(xué)研究十分有利的工具。但目前來看, 還存在相當(dāng)多的問題。例如, 不同種群同一DNA序列,同一種群不同DNA序列的進(jìn)化速率都有可能存在差異。因此, 利用基因組不同位點的基因系統(tǒng)地研究海藻的基因進(jìn)化關(guān)系就顯得更為重要和迫切, 這樣得到的結(jié)果相對單純憑借一個DNA序列進(jìn)行分析, 會更加客觀, 全面。在本研究中, 作者使用核基因編碼的18S rRNA基因、位于線粒體的cox2-3間隔區(qū)、以及位于葉綠體RUBISCO間隔區(qū)這三個序列研究我國的江蘺屬海藻與龍須菜的系統(tǒng)進(jìn)化, 研究結(jié)果進(jìn)一步證明龍須菜并不隸屬于江蘺屬, 且相對原始。同時也表明: 扁江蘺與脆江蘺,G. dura與G. debilis具有較近的親緣關(guān)系;G. gracilis分化較早, 是江蘺屬內(nèi)較為原始的物種; cox2-3間隔區(qū)、RUBISCO間隔區(qū)比起18S rRNA更適用于研究江蘺屬海藻的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

致謝: 感謝中國科學(xué)院海洋研究所夏邦美老師在物種分類鑒定方面的幫助與指導(dǎo)。本項目得到了中國科學(xué)院野生生物資源庫運補(bǔ)費項目的資助。

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