柴油分散液對馬糞海膽細胞色素P450活性的影響

馬忠強, 高亞麗, 剛 錳, 楊柏林, 熊德琪

(大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 大連116026)

馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus)是海洋底棲環(huán)境中比較常見的無脊椎動物, 在系統(tǒng)分類學(xué)上屬于棘皮動物門、游在亞門、海膽綱、正形目、球海膽科。細胞中的細胞色素P450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上, 作為一種末端加氧酶, 參與生物體內(nèi)的甾醇類激素合成等過程。近年來, 對細胞色素P450的結(jié)構(gòu)、功能, 特別是對其在藥物代謝中的作用的研究有了較大的進展。最新研究表明, 細胞色素P450還是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶, 對細胞因子和體溫調(diào)節(jié)都有重要影響, 最早的研究是在魚類肝臟中P450展開的。目前, 魚肝細胞色素P4501A作為有機物污染的監(jiān)測指標(biāo)已經(jīng)大量地應(yīng)用于野外現(xiàn)場研究和實驗室研究[1-3]。太平洋牡蠣經(jīng)過石油烴污染暴露后, 通過RT-PCR研究表明, P4501A1基因、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因的mRNA表達水平增加[4]。本文以馬糞海膽為受試生物, 研究在三個不同柴油分散液濃度下, 海膽三個部位P450活性的變化規(guī)律, 研究結(jié)果可為石油烴對海洋生物的影響和污染監(jiān)測提供有效的技術(shù)方法。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器

馬糞海膽采于大連太平洋水產(chǎn)養(yǎng)殖場。選取發(fā)育良好、個體大的海膽進行試驗(海膽的平均體重為81.3 g, 平均殼長為6.4 cm,平均殼高為3.2 cm)。海水取自大連灣, 經(jīng)沉淀過濾后用于試驗, 溫度為(22±2)℃, 鹽度為31.35, 電導(dǎo)率為47.3 S/m, pH為8.13。

四氯化碳為分光純; 無水Na2SO4、濃H2SO4、鹽酸、NaCl均為分析純; 相關(guān)試劑盒購自美國ADL公司; 0號柴油購于大連凌水加油站。

JDS-109U紅外測油儀、JB－3型磁力攪拌器、Thermo高速冷凍離心機、HH-S水浴鍋、酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 受試液的制備

柴油分散液(WAFs)的制備: 將 0號柴油和海水以1∶9的比例進行混合。用磁力攪拌器連續(xù)攪拌24 h, 分液漏斗中靜置4 h, 下層的水相為母液, 于4 ℃保存, 使用時候以紅外測油儀進行濃度測定, 并稀釋成試驗需要的濃度。

1.2.2 亞急性毒性試驗

設(shè)定 3個濃度組, 每個濃度組投入充足的稀釋液, 每組投放15只海膽。試驗期間12 h換稀釋液1次, 并進行打氧和投餌。

3個濃度組分別為5、20、50 mg/L(以下分別用低濃度、中濃度、高濃度來表示), 測定時間分別設(shè)為第2、4、8、12天?；謴?fù)試驗結(jié)束時間為25 d,測定的部位為腸體、體液和性腺。

在每組濃度、每個測定時間下, 分別取出3只海膽對其三個部位進行P450酶含量的測定, 在12 d后,每個濃度組還剩下3只海膽, 然后, 把這3只海膽放進干凈的海水中進行恢復(fù)試驗, 直到25 d后再測定三個部位酶的活性。另外, 同時在干凈的海水中飼養(yǎng)15只健康的海膽, 用于空白對照試驗。(注: 對海膽進行酶測定的時候都要得到3只海膽酶活性的數(shù)值,然后進行平均求值, 此數(shù)值為在此濃度和此測定時間P450活性的最終結(jié)果。)

1.2.3 酶活性的測定方法

(1)稱取一定質(zhì)量的性腺或者腸體(約0.2～1 g),用冰冷的生理鹽水漂洗, 濾紙拭干, 稱重, 放入5～10 mL的小燒杯中。

(2)用量筒取冰冷的生理鹽水(0.86%的生理鹽水的質(zhì)量應(yīng)該是組織質(zhì)量的9倍), 用移液管將總量2/3的生理鹽水移入燒杯中, 用剪子盡快剪碎組織塊(氣溫高時要放在冰上進行)。

(3)將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中, 再把剩余的1/3的生理鹽水沖洗殘余在燒杯中的碎組織一起倒入勻漿管中勻漿, 充分勻漿后, 把此勻漿液用離心機3000 r/min離心15 min, 之后留上清液用于試驗的測定。

(4)體液酶活性測定, 取海膽體液20 μL, 用蒸餾水稀釋至1 mL, 配成1∶49的溶液, 然后充分放置5 min直到使玻璃管中的溶液對光呈完全透明狀, 才能進行酶的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬糞海膽不同部位的P450含量

馬糞海膽不同組織中的P450含量測定結(jié)果見表1?？梢钥闯? 在正常條件下, 腸體、性腺和體液中的P450含量有明顯差異。

表1 馬糞海膽不同部位的P450含量測定結(jié)果Tab.1 The P450 content in different tissues of Hemicentrotus pulcherrimus

2.2 柴油分散液對馬糞海膽P450活性的影響

圖1 不同柴油分散液質(zhì)量濃度下馬糞海膽腸體中P450含量隨時間的變化Fig.1 The time-effect response of P450 activity in intestine of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

2.2.1 柴油分散液對馬糞海膽腸體的 P450活性的影響

圖1為柴油分散液對海膽腸體P450活性影響試驗結(jié)果。從圖中可以看到: 2 d時, 低、中濃度組和對照組相比幾乎無顯著差異, 但是高濃度組P450的活性則被誘導(dǎo), 與前兩個濃度梯度存在較為明顯的差異; 4 d時, 中濃度組P450的含量開始誘導(dǎo), 而高濃度組的活性開始回落; 在第 8 天時, 低濃度組 P450的含量被誘導(dǎo), 后兩個濃度組還是在回落; 第12 天時, 這三個濃度組的P450含量較之前都有所回落。所以, 柴油分散液對馬糞海膽腸部P450的含量影響最為明顯。從圖中還可以看到, 三個濃度組下馬糞海膽腸部的 P450含量隨時間的變化情況, P450含量首先增加然后降低, 即活性先被誘導(dǎo)后被抑制。第2天時, 高濃度組的含量是對照組的 143%; 但是當(dāng)恢復(fù)試驗結(jié)束的時候, 三組濃度下的腸體P450含量基本與對照組一致。

2.2.2 柴油分散液對馬糞海膽體液P450活性的影響

從圖2中可以看到: 2 d時, 低濃度組和對照組之間沒有明顯的差異, 中濃度組P450的含量比較低,高濃度組P450明顯增加, 和中濃度組之間有顯著差異; 4 d時低濃度組P450含量增高, 高濃度組P450

含量達到高峰; 第8 天時, 前兩個濃度組P450含量達到高峰, 而高濃度 P450含量開始回落; 第 12 天時, 前兩個濃度組較第 8 天時有所回落, 但是高濃度組反而升高。所以, 柴油分散液對馬糞海膽體液P450含量的影響也比較顯著。三組濃度下, 隨著時間的推移, 體液中的 P450含量先增加后下降, 效應(yīng)顯著。當(dāng)恢復(fù)試驗結(jié)束的時候, 三個濃度組之間體液中的P450活性差異基本消除, 與對照組一致。

2.2.3 柴油分散液對馬糞海膽性腺P450活性的影響

圖2 不同柴油分散液質(zhì)量濃度下馬糞海膽體液P450含量隨時間的變化Fig.2 The time-effect response of P450 activity in coelomic fluid of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

圖3 不同柴油分散液質(zhì)量濃度下馬糞海膽性腺P450含量隨時間的變化Fig.3 The time-effect response of P450 activity in gonad of Hemicentrotus pulcherrimus with different concentrations of diesel

從圖3中可以看到: 對照組P450的含量比較穩(wěn)定。2 d時, 三個濃度組P450的含量都有明顯的增加,與濃度成正比關(guān)系; 4 d時低濃度組P450含量增高,中、高濃度組P450含量明顯下降; 第8 天時低濃度組的 P450也開始有所回落; 第 12 天時, 這三個濃度組較第 8 天也是略有回落。所以, 柴油分散液對馬糞海膽性腺P450含量的影響也比較顯著。隨著時間的推移, 性腺中的 P450含量先增加后下降, 明顯產(chǎn)生了先誘導(dǎo)后抑制的效應(yīng)。當(dāng)恢復(fù)試驗結(jié)束的時候, 三個濃度組之間性腺中的P450活性差異基本消除, 與對照組趨于一致。

2.2.4 柴油分散液暴露下海膽 P450活性的變化規(guī)律比較

從表2可以看出, 油污染會明顯影響海膽體內(nèi)各部位的P450活性, 總體上呈現(xiàn)先誘導(dǎo)、后抑制的規(guī)律。隨著油濃度的增加, 最大誘導(dǎo)率也在增加, 并且高濃度組時P450出現(xiàn)誘導(dǎo)的時間比低濃度組要早。隨著暴露時間的增加, P450活性逐漸被抑制, 且濃度越高, 抑制作用出現(xiàn)的時間越早。

表2 不同油濃度下海膽三個部位P450活性的變化情況比較Tab.2 Effects of different concentrations of WAFs on P450 activities

3 討論

從實驗結(jié)果可以看出: 在柴油分散液的低濃度和中濃度組條件下, 海膽的腸體、體液和性腺等不同部位的P450酶一般在暴露4～8 d后會出現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng), 在8～12 d后開始產(chǎn)生抑制作用。而在高濃度時, 各部位的P450含量在暴露2～4 d時就會迅速提高, 達到峰值, 之后開始逐漸受到抑制, 甚至低于正常水平。說明油污染會顯著影響海膽的抗氧化還原系統(tǒng), 在油污染程度較低時和污染初期, 由于海膽抗氧化還原系統(tǒng)對污染的應(yīng)激反應(yīng), 細胞色素P450活性首先被誘導(dǎo), 并且污染程度越大, 海膽抗氧化還原系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)得越早, 作用越強; 但隨著污染程度和時間的增加, 由于中毒反應(yīng)導(dǎo)致酶活性受到抑制而逐漸下降。在停止污染暴露12 d左右時間后, 各部位P450含量會逐漸恢復(fù)到原來水平, 說明海膽抗氧化還原系統(tǒng)具有一定的自我修復(fù)能力。

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)在受到有毒物質(zhì)作用時, 生物體內(nèi)酶活性總體上會呈現(xiàn)先升后降的趨勢[5-9]。利用該現(xiàn)象, 國外學(xué)者以 P450作為毒理學(xué)指標(biāo), 在多環(huán)芳烴(PAHs)、PCBs、TCDDs的生物監(jiān)測方面做了較多的研究工作。如法國選擇了兩種海魚的 EROD活性作為監(jiān)測PAHs和PCBs的指標(biāo), 對周邊海域環(huán)境進行監(jiān)測[10]。挪威也把鯰魚CYPIA的誘導(dǎo)作為監(jiān)測周邊海域石油烴、PAHs、PCBs、PCDDs、其他鹵代化合物、農(nóng)藥等污染的指標(biāo)[11]。相對來說, 國內(nèi)在此方面的研究較少, 只有朱必鳳[12]提出可用鯽魚肝微粒體芳烴羥化(AHH)酶指示水體中多環(huán)芳烴污染等少量成果報道。因此本文以海膽為對象研究其體內(nèi)P450酶受石油烴污染的影響規(guī)律具有重要的意義,海膽P450活性可作為海洋中石油烴污染程度監(jiān)測的毒理學(xué)指標(biāo)。

[1]Codi S, Humphrey C, Klumpp D, et al. Barramundi as an indicator species for environmental monitoring in North Queensland, Australia: laboratory versus field studies[J]. Environ Toxicol Chem,2004, 23(11):2737-2744.

[2]Den Besten P J, Valk S, Van Weerlee E, et al.Bioaccumulation and biomarkers in the sea star Asterias rubens (Echinodermata: Asteroidea): a North Sea field study[J]. Mar Environ Res,2001, 51(4): 365-387.

[3]Kopecka-Pilarczyk J, Correia A D. Biochemical response in gilthead seabream (Sparus aurata)to in vivo exposure to a mix of selected PAHs[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2009, 72(4): 1296-1302.

[4]Hansen B H, Altin D, Hessen K M,et al. Expression of ecdysteroids and cytochrome P450 enzymes during lipid turnover and reproduction in Calanus finmarchicus(Crustacea: Copepoda)[J]. Gen Comp Endocrinol,2008,158(1): 115-121.

[5]Pascual P, Pedrajas J R, Toribio F, et al. Effect of Food Deprivation on Oxidative Stress Biomarkers in Fish(Sparus aurata)[J]. Chemico-Biological Interactions,2003, 145: 191-199.

[6]Oruc E O, Sevgiler Y, Uner N, et al. Tissue-Specific Oxidative Stress Responses in Fish Exposed to 2,4-D and Azinphosmethyl[J]. Biological Sciences, 2004, 137:43-51.

[7]Box A, Sureda A, Deudero S, et al. Antioxidant response of the bivalve Pinna nobilis colonised by invasive red macroalgae Lophocladia lallemandii[J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2009, 149:456-60.

[8]Cheung C C, Siu W H, Richardson B J, et al. Antioxidant responses to benzo[a]pyrene and Aroclor 1254 exposure in the green-Lipped mussel, Perna viridis[J]. Environ Pollut,2004, 128: 393-403.

[9]Martín-Díaz M L, Blasco J, Sales D, et al. Field validation of a battery of biomarkers to assess sediment quality in Spanish ports[J]. Environ Pollut, 2008, 151: 631-640.

[10]Galgani F. Monitoring of pollutant biochemical effects on marine organisms of the French coasts[J].Oceanologica ACTA, 1992, 15: 52-61.

[11]Anders Gokso yr. Characterization of the cytochrome P450 mono-oxygenase system in fish liver, metabolism and effects of organic xenobiotics[D]. Trodheim: Norweigian University of Science and Technology, 1987.

[12]朱必鳳, 馬海燕. 鯽魚肝微粒體芳烴羥化酶指示多環(huán)芳烴對水體污染的研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 1995,15:153-156.