一株聚-β-羥基丁酸酯高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

王利群，王明慧，汪 云，卿 青，周 玨，張?jiān)旅?，?蓉

（1常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 常州 213164；2常州市藥品制造與質(zhì)量控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213164）

聚羥基烷酸酯（poly-hydroxyalkanoates，PHAs）是微生物因繁殖受限但碳源過剩時(shí)，作為能源物質(zhì)在胞內(nèi)積聚的鏈狀聚酯[1]，是一種可加工的熱性聚酯。在環(huán)境適宜時(shí)，微生物會(huì)將這種聚酯分解并加以利用，該特性使其無論在自然界亦或是在生物體內(nèi)都會(huì)被分解、資源化。而聚羥基丁酸酯（poly-βhydroxybutyrate，PHB）是PHAs單體中發(fā)現(xiàn)最早、結(jié)構(gòu)最簡單、研究最多的一種結(jié)構(gòu)[2]。國內(nèi)外對PHB產(chǎn)生菌研究最多的是真產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes eutrophus，但大多數(shù)野生型真產(chǎn)堿桿菌的發(fā)酵周期長達(dá)100 h；周琴等[3]分離出的巨大芽孢桿菌Bm-10在發(fā)酵40 h后PHB產(chǎn)量達(dá)到0.763 g/L；徐愛玲等[4]報(bào)道的Acidiphilium cryptumDX1-1通過誘變改良，發(fā)酵時(shí)間仍需要80 h。Pinar Kaynar等[5]從魚內(nèi)臟中篩選獲得30株芽孢桿菌，其中巴氏芽孢桿菌P2中PHB占菌體干重的20.58%，而緩慢芽孢桿菌P18中達(dá)到23.38%。目前，發(fā)酵法制備PHB存在原料較貴、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、提純工藝復(fù)雜等問題[6]。英國帝國化學(xué)公司（ICI）曾就PHB工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)因素進(jìn)行了評估，主要影響因素有菌種、原料、操作方式以及提取方法等[7]。生產(chǎn)成本是工業(yè)化制備PHB的主要障礙之一。

本研究從菌種和原料出發(fā)，篩選高產(chǎn)菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，以降低生產(chǎn)成本。土壤經(jīng)富集、蘇丹黑染色法初篩[8]，獲得純化菌株后，以PHB含量為依據(jù)進(jìn)行復(fù)篩，通過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定菌株，并對PHB發(fā)酵條件作初步研究，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

采集常州科教城天琴湖周邊土壤和淤泥樣品40份。

1.2 主要試劑

PHB標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich，蘇丹黑B購自Aladdin，其它試劑均為國產(chǎn)生化試劑或國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（g/L）：尿素 5.0，葡萄糖10.0，MgSO40.5，K2HPO40.1，pH 值7.0。

分離培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 5.0，葡萄糖12.0，瓊脂15.0，pH值7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母膏10.0，甘油10.0，葡萄糖10.0，pH值7.0。

發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基（g/L）：氮源1.0，碳源10.0，MgCl20.1，MgSO40.2，NH4Cl20.08，NaCl 1.0，KH2PO40.05，K2HPO40.06，pH 值 7.0。

1.4 菌株篩選

土樣粉碎后富集培養(yǎng)，梯度稀釋后涂布固體分離培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落反復(fù)劃線分離純化，直至獲得純培養(yǎng)。純化菌株通過蘇丹黑染色后鏡檢[9]，黑色的染色顆粒即為PHB，染色范圍的多少代表PHB含量的多少，以染色程度為依據(jù)，初步篩選產(chǎn)PHB菌株。

將初篩菌株以5%的接種量接入100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間，測定細(xì)胞干重和PHB含量[10]。細(xì)胞干重（g/L）定義為1 L發(fā)酵液8000 r/min離心10 min獲得的細(xì)胞洗滌3次后?46℃冷凍干燥24 h后的質(zhì)量。對PHB高產(chǎn)菌株進(jìn)行鑒定，并優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.5 PHB含量的測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用紫外分光光度法測定PHB含量[11]。準(zhǔn)確稱取一定量PHB標(biāo)準(zhǔn)品，加入熱的氯仿，加熱溶解后定容，得到濃度為1 mg/mL PHB氯仿溶液，取一定量的溶液加入10 mL濃硫酸沸水浴處理30 min，235 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

1.6 菌株鑒定

簡單染色和革蘭氏染色后顯微鏡觀察菌株形態(tài)和大小。生理生化實(shí)驗(yàn)參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）》[12]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]進(jìn)行。16S rDNA序列測定由生工生物工程（上海）有限公司完成。將測得的序列與GenBank中已知的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較分析。

1.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入10.0 g/L不同碳源和1.0 g/L不同氮源，同時(shí)測定發(fā)酵時(shí)間、起始pH值、溫度以及裝液量對PHB含量及PHB占細(xì)胞干重百分比的影響，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的初篩與復(fù)篩

從40份土壤樣品中分離得到36株菌株，通過蘇丹黑染色鑒定其中18株為活性菌株，染色照片見圖2。從中選擇染色較多、效果較好的8株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩結(jié)果如圖3所示，可見6號菌株中PHB含量最高，故選取6號菌株進(jìn)行鑒定及進(jìn)一步考察。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特性

顯微鏡觀察，菌株為桿狀，革蘭陰性菌，無芽孢，無鞭毛，無運(yùn)動(dòng)性。在固體培養(yǎng)基上菌落為圓形，直徑1～2 mm，邊緣整齊，淺橙黃色，質(zhì)地柔軟，黏稠狀。部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 菌株部分生理生化反應(yīng)特征

2.2.2 16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

菌株CCZU-6X的16S rDNA序列如下。

將測得的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示，與紅球菌屬（Rhodococcussp.）的同源性大于99.9%。結(jié)合其菌落形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步確定為Rhodococcussp.，并命名為Rhodococcussp.CCZU-6X。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 菌株生長周期對PHB積累量的影響

首先考察了基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株生長周期對PHB積累的影響，結(jié)果見圖5。菌株對數(shù)生長前期，PHB積累速度較低；而在對數(shù)生長后期，PHB積累速度較高，這表明在對數(shù)生長前期，營養(yǎng)物質(zhì)大多應(yīng)用于細(xì)菌的生長，對數(shù)生長后期及穩(wěn)定期初期，菌株生長受限，將營養(yǎng)物質(zhì)以PHB的形式積累于胞內(nèi)。菌株生長于12～15 h達(dá)到穩(wěn)定期，PHB積累于18 h達(dá)到最大值。即該菌株用于PHB生產(chǎn)的發(fā)酵周期為18 h，與Ishizaki等[14]的40 h和崔志芳等[15]的24 h相比，所需時(shí)間更短，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3.2 碳源和氮源對菌株積累PHB的影響

碳源為微生物生長代謝過程提供碳架和能量，也是微生物合成PHB的原料。以2 g/L酵母粉為氮源，考察了7種不同碳源對菌株積累PHB的影響，如圖6。由圖6可知，不同碳源對PHB積累量影響較小，而對PHB占細(xì)菌干重百分比有較大影響。乳糖作為碳源時(shí)，PHB質(zhì)量占細(xì)胞干重的百分比最高，達(dá)39.05%，同時(shí)PHB的積累量也較高，達(dá)2.1 g/L。周琴等[3]報(bào)道，以葡萄糖為碳源，Bacillus mageterium的PHB最高產(chǎn)量為0.763 g/L；徐浩等[16]報(bào)道，以2%的葡萄糖為碳源，Alcaligenes laius的PHB占細(xì)胞干重為23.9%?？梢?，以乳糖為碳源，Rhodococcussp.CCZU-6X PHB產(chǎn)量及占細(xì)胞干重百分比均具有優(yōu)勢。另外，PHB占細(xì)胞干重百分比越高，對產(chǎn)物分離純化越有利。因此，選擇乳糖作為最適碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成，尤其是酶的合成[17]。以10 g/L乳糖為碳源，考察了7種不同氮源對菌株積累PHB的影響，見圖7。由圖7可知，不同氮源對PHB占細(xì)胞干重百分比的影響非常顯著。硫酸銨作為氮源時(shí)PHB的積累量較高，達(dá)2.9 g/L，同時(shí)PHB占細(xì)胞干重的百分比最高，為32.6%，且硫酸銨價(jià)格便宜。因此，選擇硫酸銨為最佳氮源。

進(jìn)一步考察乳糖濃度和硫酸銨濃度對菌株積累PHB的影響，結(jié)果如圖8和圖9所示。隨著碳、氮源濃度的增加，PHB產(chǎn)量及占細(xì)胞干重比都是呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，且變化趨勢一致。由圖8可知，當(dāng)乳糖濃度為10 g/L時(shí)，PHB的產(chǎn)量及其占細(xì)胞干重的百分比均達(dá)到最大值，分別為2.15 g/L和39.0%。從圖9可知，硫酸銨濃度為2.0 g/L時(shí)，PHB的產(chǎn)量及其占細(xì)胞干重的百分比均最大，分別為3.23 g/L和70.9%。因此，乳糖和硫酸銨的最適濃度分別為10 g/L和2 g/L。

2.3.3 培養(yǎng)基起始pH值對PHB積累的影響

通常，培養(yǎng)基起始pH值會(huì)影響微生物發(fā)酵和產(chǎn)物生產(chǎn)[18]。不同起始pH值對CCZU-6X積累PHB的影響如圖10所示。結(jié)果表明，pH值對菌株積累PHB的影響較為顯著，pH值7.5時(shí)，PHB產(chǎn)量和占細(xì)胞干重的百分比均達(dá)到最大，分別為2.85 g/L和79.1%。因此，CCZU-6X積累PHB的最適初始pH值為7.5。

2.3.4 培養(yǎng)溫度對PHB積累量的影響

培養(yǎng)溫度通常會(huì)影響微生物的生長繁殖和產(chǎn)物積累[19]。由圖11可知，溫度對PHB積累影響顯著。當(dāng)溫度低于30℃時(shí)，PHB產(chǎn)量和占細(xì)胞干重百分比隨溫度升高而增加；溫度在30～40℃之間，PHB產(chǎn)量隨溫度升高而下降，而PHB占細(xì)胞干重比變化不大。溫度為30℃時(shí)，PHB產(chǎn)量及占細(xì)胞干重比均為最大值，分別為2.35 g/L和79.1%。因此，30℃為該菌株發(fā)酵生產(chǎn)PHB的最適溫度。

2.3.5 培養(yǎng)基裝液量對PHB積累的影響

培養(yǎng)基裝液量會(huì)影響培養(yǎng)基中的溶氧濃度，從而影響菌體生長和產(chǎn)物積累[20]。如圖12所示，250 mL錐形瓶中裝液量為30 mL時(shí)，PHB的產(chǎn)量為2.87 g/L且占細(xì)胞干重的75.5%，而裝液量為40 mL和50 mL時(shí)，盡管PHB占細(xì)胞干重的百分比沒有明顯變化，但其產(chǎn)量顯著下降。隨著裝液量的繼續(xù)增加，PHB積累受到顯著影響，呈現(xiàn)出較為明顯的下降。結(jié)合PHB產(chǎn)量及其占細(xì)胞干重比，選取在250 mL錐形瓶中的最適裝液量為30 mL。

2.3.6 優(yōu)化條件下的生長曲線與PHB積累進(jìn)程

在優(yōu)化條件下，對菌株生長曲線和產(chǎn)物PHB積累進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測，如圖13所示。菌體生長于13 h左右達(dá)到穩(wěn)定期，而PHB積累量仍于18 h時(shí)達(dá)到最高，達(dá)4.54 g/L，占細(xì)胞干重的79.52%。表明發(fā)酵條件優(yōu)化后，PHB產(chǎn)量及其占細(xì)菌干重的比例均有顯著提高。

3 結(jié)論

PHB具有多種優(yōu)良特性，基于其生物相容性、可降解性、疏水性、不透氧性以及壓電性，可以在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中用作動(dòng)物以及人體骨科手術(shù)中的骨釘、骨棒等骨支架材料，它的增強(qiáng)作用和粗糙表面可以促進(jìn)新骨組織的生長，空隙用作滲透和交換，同時(shí)在體內(nèi)降解成為PHB單體分子，不會(huì)帶來任何毒副作用[21]，這一應(yīng)用前景引起了人們對微生物發(fā)酵生產(chǎn)PHB的更多關(guān)注。本研究采用富集培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基，通過對菌株的初篩與復(fù)篩，成功從土壤中篩選出一株P(guān)HB的高產(chǎn)菌株，鑒定為Rhodococcussp.，與已經(jīng)報(bào)道的產(chǎn)PHB菌株相比，該菌株具有利用廉價(jià)原料快速高效合成PHB的特點(diǎn)。通過對發(fā)酵培養(yǎng)基以及條件的優(yōu)化，確定最適碳、氮源分別為10 g/L乳糖和2 g/L硫酸銨，培養(yǎng)溫度為30℃、起始pH值為7.5、裝液量為30 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為160 r/min，發(fā)酵18 h，PHB積累達(dá)到細(xì)胞干重的79.52%，產(chǎn)量為4.54 g/L，在工業(yè)上有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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