氨基脲對雄性小鼠生殖功能的影響

袁 萍 周 艷 鄒學敏 劉 晶 李東陽

（長沙醫(yī)學院 湖南 衡陽 421001）

氨基脲（semicarbazide，SEM）是偶氮甲酰胺、角叉膠、次氯酸鹽、蛋粉及溶解酵素等食品添加劑類的分解產(chǎn)物，酸奶洛、冰淇淋、蛋的加工、蝦類的漂白及肉品生產(chǎn)等環(huán)節(jié)中含有氨基脲［1－3］。近年來，許多研究者還在蜂蜜、果汁、兒童食品、泡菜、啤酒、芥末和番茄醬及硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物中檢測出SEM［4－6］。研究表明，氨基脲具有胚胎、免疫、染色體畸變等器官毒性及致癌性［7－8］。有實驗證實，氨基脲可使雄性小鼠精子精子活動降低、畸形率升高、數(shù)量減少，睪丸中酸性磷酸酶（ACP）活性升高，乳酸脫氫酶（LDH－X）活性下降，各級生精細胞的變性壞死，造成雄性動物不育［9］。本實驗用SEM對雄性小鼠染毒，探討SEM對雄性小鼠生殖功能的影響及其機制，旨在為防治SEM致男性生殖毒性損傷提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物：SPF清潔級健康成年KM種雄性小鼠40只，體重為26±6克，由南華大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證書編號：SCXK（湘）2005－0010。

1.2 主要試劑與儀器：純度＞99%SEM采購于天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；LDH－X試劑盒、ACP試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；CK40光學顯微鏡購于日本OLYMPUS公司；80℃，SLT－13V－85型超低溫冰箱購于美國HARRIS公司；AB204－N型電子分析天平購于METTLER公司；80－2型臺式低速離心機購于上海手術(shù)器械廠。

1.3 配制主要試劑：10%福爾馬林：量取40%分析純甲醛溶液，用新鮮去離子水稀釋，甲醛溶液：新鮮去離子水為1∶9。SEM混懸液：按30、60、120mg／kg.bw 秤取 SEM 顆粒，按10ml／kg.bw 計算灌胃體積，把SEM灌胃液濃度確定為 3、6、12mg／ml。秤取 SEM3、6、12g攪溶于1000ml去離子水中，制成低、中、高劑量（3、6、9mg／ml）SEM 混懸液，即用現(xiàn)配。PH6.8的磷酸鹽緩沖液：量取l／15mol／磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液50.5ml和1／15mol／L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液49.5ml完全混合。

1.4 動物分組、飼養(yǎng)與處理：40只SPF清潔級健康成年KM種雄性小鼠，隨機分為4組，10只／組，分組如下：溶劑對照組、低劑量SEM染毒組、中劑量SEM染毒組、高劑量SEM染毒組。溶劑對照組灌胃去離子水，連續(xù)6周；SEM 染毒組按30、60、120mg／kg.bwSEM 溶液灌胃體積為10ml／kg·bw，連續(xù)灌胃6周。以上各組灌胃溶液的溶劑均用去離子水稀釋，各組均每天上午9點至10點進行灌胃，1次／日，各組雄性小鼠均按體重1／10給予全價顆粒飼料分籠喂養(yǎng)，飲水自由。最后一次灌胃24h后，摘取眼球采血，用頸椎脫臼法處死小鼠，對雙側(cè)睪丸、附睪進行仔細分離，檢測相關(guān)生殖指標。

1.5 檢測方法和觀察指標：迅速夾取一側(cè)新鮮附睪尾置于5mL生理鹽水（37℃預熱）中，用眼科剪縱向剪開，吸管吹打，37℃水浴中靜置5min。用4層擦鏡紙過濾，取濾液1mL，用9mL 37℃生理鹽水混勻制成10mL精子懸液。將精子懸液放在60℃水浴，時間5min，吸取1滴精子懸液涂片，置于空氣中晾干，用甲醇固定、干燥，用1%的伊紅Y染液染色，時間30min，用流水沖洗，自然晾干，在400倍油鏡下觀察1000個精子形態(tài)（包括胖頭、雙頭、無鉤、不定形、香蕉形、折體、雙尾、尾折疊等）。計算畸形率：精子畸形率（%）＝［精子畸形總數(shù)÷總精子數(shù)（1000）］×100。取睪丸實質(zhì)部分制備組織勻漿液，按試劑盒說明操作分別測定LDH－X、ACP酶的活性量；常規(guī)病理學切片，HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學變化。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)和精子畸形率的影響見表1。高劑量SEM染毒組雄性小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)低于溶劑對照組（P＜0.05）；與溶劑對照組比較，不同劑量SEM染毒組雄性小鼠精子畸形率均增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；精子畸形主要以彎頸、雙頭、胖頭、不定型、折體、卷尾為主。

表1 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)及精子畸形率的影響（）

表1 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)及精子畸形率的影響（）

＊：P＜0.05υs溶劑對照組

組別 例數(shù) 睪丸／體（%） 附睪／體（%） 畸形率（%）10 1.80±0.140.51±0.13 1.15±0.13低劑量SEM 染毒組 10 0.87±0.09 0.24±0.07 9.22±0.86＊中劑量SEM 染毒組 10 0.85±0.13 0.23±0.12 16.17±0.78＊高劑量SEM染毒組 100.798±0.08＊ 0.22±0.09＊ 18.16±0.98溶劑對照組＊

2.2 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸組織形態(tài)學影響：睪丸病理組織學觀察顯示：溶劑對照組雄性小鼠睪丸曲細精管上皮細胞層次未見異常，外壁光滑無褶皺，曲細精管充實飽滿，管腔中無脫落的細胞，管腔中可見到大量成熟精子；低劑量組睪丸部分曲細精管上皮細胞層次排列紊亂，有少許上皮細胞層與基底細胞層部分離甚至缺失脫落，中、高劑量SEM染毒組除了有上述病變外，曲細精管腔擴張，管內(nèi)細胞排列疏松紊亂，腔內(nèi)精子稀少甚至無精子（見圖1）。

圖1 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸組織形態(tài)觀察。

2.3 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸LDH－X、ACP含量的影響見表2。與溶劑對照組比較，不同劑量SEM染毒組小鼠睪丸組織LDH－X降低、低劑量SEM染毒組小鼠睪丸組織ACP含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸中LDH－X和ACP酶活性的影響（）

表2 不同劑量SEM對雄性小鼠睪丸中LDH－X和ACP酶活性的影響（）

＊：P＜0.05υs溶劑對照組

10 1128.25±61.08 26.95±1.97低劑量SEM染毒組 10 736.17±62.49＊ 31.16±2.03＊中劑量SEM染毒組 10 698.18±72.33＊ 30.36±2.23高劑量SEM 染毒組 10 497.94±68.82＊29.73±2.35溶劑對照組

3 討論

不同劑量SEM對雄性小鼠染毒實驗形態(tài)學結(jié)果：睪丸病理組織學檢查顯示，睪丸部分曲細精管上皮細胞層次排列紊亂，有少許上皮細胞層與基底細胞層部分離甚至缺失脫落，曲細精管腔擴張，管內(nèi)細胞排列疏松紊亂，腔內(nèi)精子稀少甚至沒有；其中精子的活動度大多降低，精子畸形率不同程度增多，精子畸形主要以彎頸、雙頭、胖頭、不定型、折體、卷尾為主。特別是中、高劑量SEM染毒組雄性小鼠精子畸形率增高更明顯。有實驗研究證明，睪丸支持細胞是一些睪丸毒物作用的原始靶點。睪丸毒物可以使生精細胞不同程度地從支持細胞上脫落缺失，SEM染毒實驗結(jié)果也證明，SEM通過灌胃染毒可能對睪丸支持細胞的直接損傷作用和或不同程度影響LDH－X和ACP的活性，從而使生精細胞從支持細胞脫落缺失，干擾精子的生成與成熟，導致染毒雄性小鼠睪丸臟器系數(shù)降低，因而影響染毒雄性小鼠的生殖功能。

睪丸中的許多酶在精子發(fā)生和精子成熟過程中起著很重要的作用。精子的發(fā)生與成熟依賴于其生存內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及相關(guān)激素和酶類的調(diào)節(jié)［10］。LDH－X屬于糖酵解酶系，主要是生精細胞 ）糖代謝產(chǎn)生能量的其中一種酶，主要位于精子細胞胞質(zhì)、精母細胞、精子尾中段線粒體上，是生精細胞成熟的標志酶之一［11－12］；ACP為精子特異酶，是精細胞溶酶體的前體，ACP活性可能與其吞噬功能很有關(guān)，可以作為衡量能否有生精功能障礙的指標［13］。

LDH－X主要存在于線粒體上，能進行無氧代謝催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。因睪丸曲細精管精母細胞粗線后期的各級生精細胞位于睪丸支持細胞的上方，很難直接通過基膜從間質(zhì)獲取營養(yǎng)，而主要通過糖酵解進行，故LDH－X是生精細胞糖代謝產(chǎn)生能量的主要酶，LDH－X活性與生精過程、精子活動、獲能及受精有關(guān)，因而可以作為預測生精能力的重要指標。如果抑制LDH－X的活性，可能會影響生精細胞生成和成熟，使精子數(shù)量減少甚至沒有，活動力下降，引起精子畸形率增加，導致雄性生育能力下降。SEM染毒實驗結(jié)果顯示，LDH－X活性降低，其精子數(shù)量減少甚至沒有、精子畸形率增加。

精液中ACP是前列腺的特征性分泌物，是檢驗有無精液最敏感的方法。睪丸ACP為支持細胞溶酶體的特異酶，其可催化糖磷酸酯脫磷酸轉(zhuǎn)化成果糖，給精子提供游動的能量。人精漿中富含ACP酶，有實驗證實其能抑制NK細胞和中性粒細胞的活性，具有免疫抑制作用，可以使精子在女性生殖道中不被排斥。本實驗證明低劑量SEM染毒組能使睪丸ACP活性升高，低劑量SEM染毒組是阻礙精子獲得能量和其他活動能力的敏感劑量，有可能是導致雄性生育能力下降甚至不育的重要原因。

綜上所述，接觸SEM的雄性小鼠，SEM可能是通過影響睪丸組織酶的活性，抑制精子的生成與成熟，直接作用于支持細胞使生精細胞不同程度地從支持細胞上脫落缺失，從而影響雄性小鼠生殖功能。

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