針刺對(duì)哮喘大鼠肺組織pan-Ras/c-fos蛋白表達(dá)的影響*

崔建美，楊曉溪，劉慧娟，孫 娜，喇孝瑾，王洪彬

(河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

1 引言

在以往的針刺抗哮喘機(jī)理研究中，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從大鼠肺組織中找到一種針刺抗哮喘的差異表達(dá)蛋白，即 Ras抑制蛋白1。該蛋白僅存在哮喘模型組，經(jīng)針刺處理后該蛋白消失。目前Ras抑制蛋白1的體內(nèi)功能并不清楚。為進(jìn)一步明確針刺與Ras依賴型的絲裂素活化蛋白激酶(Ras-MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系及對(duì)其影響，本研究采用免疫組化等方法檢測(cè)Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中主要蛋白pan-Ras及c-fos的表達(dá)，從而進(jìn)一步探討針刺對(duì)哮喘的治療及作用機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量117±8.03g，購(gòu)于天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司(許可證號(hào)SCXK(津)2009-0001)。動(dòng)物飼養(yǎng)在河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施［SYXK(冀)2010-0038］，環(huán)境溫度 20℃～25℃，濕度 60%～70%，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用采取“3R”原則，給予人道關(guān)懷。大鼠飼料購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào) SCXK(京)2009-0008)，動(dòng)物飲水采用超濾系統(tǒng)處理的無菌水。

2.2 主要試劑和儀器

OVA(美國(guó) Sigma A5378)，Al(OH)3凝膠(天津歐博凱化工有限公司，批號(hào)20110711)，兔抗大鼠pan-Ras多克隆抗體(Santa Cruz)，兔抗大鼠c-fos多克隆抗體(Biolegend)，超敏 SP試劑盒(Kit-9710，福州邁新生物公司)，DAB(Kit-0031，福州邁新生物公司);切片機(jī)(德國(guó)萊卡，型號(hào)RM2235)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，型號(hào) BX51)，Image pro plus6.0(美國(guó)Media Cybernetics)。

2.3 方法

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組10只。分別為空白組:未給予任何處理;哮喘模型組:復(fù)制哮喘模型，無針刺處理;哮喘模型針刺組:自造模之日起按照下述針刺干預(yù)方法處理。

2.3.2 動(dòng)物模型制備 哮喘模型組及哮喘模型針刺組SD大鼠分別一次性腹腔注射含OVA1mg和Al(OH)310mg的生理鹽水1ml，2周后頸外靜脈內(nèi)注射 OVA(15mg/kg)，激發(fā)哮喘發(fā)作［1］。

2.3.3 針刺干預(yù) 取穴:取大椎、肺俞(雙)、風(fēng)門(雙)［1］，依照6版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》“大鼠常用穴位定位方法”定位。大椎:第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。肺俞:第3胸椎下兩旁肋間。風(fēng)門:第2胸椎下兩旁肋間。

針刺方法:平補(bǔ)平瀉，每次留針20 min，每隔5 min行針1次(以200次/min捻轉(zhuǎn)速度，捻針20次為行針1次)，隔日針刺1次，共7次。

2.3.4 切片制備 哮喘模型組及哮喘模型針刺組用10%的水合氯醛按3.5ml/kg腹腔注射麻醉。結(jié)扎大鼠右肺中葉，右心室頭皮針插管并剪開左心耳，以無菌生理鹽水進(jìn)行肺循環(huán)灌注至雙肺呈蒼白色。整體取出心肺和氣管，清除心臟、氣管、大血管和肺門周圍結(jié)締組織，剝離肺用生理鹽水漂洗干凈，吸水紙?jiān)嚫伞＜舫鼋Y(jié)扎的右肺中葉，4%甲醛固定，24h后石蠟包埋。

2.3.5 肺組織病理學(xué)觀察 各組大鼠肺組織石蠟切片分別行蘇木素伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察氣道、肺組織病理學(xué)改變。

2.3.6 肺組織pan-Ras及c-fos蛋白表達(dá)的檢測(cè) 免疫組織化學(xué)染色采用SABC法，實(shí)驗(yàn)操作按S-P試劑盒說明書進(jìn)行并略加修正。其步驟如下:(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3×5min;(2)高壓修復(fù)抗原，修復(fù)液枸櫞酸鹽(自制)，待噴氣1.5min后冷水冷卻，PBS洗3×5min;(3)滴加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(S-P試劑盒A試劑)室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS洗3×5min;(4)滴加非免疫性羊血清(S-P試劑盒 B試劑)，室溫下孵育20min，以減少非特異性背景，無需沖洗，倒去多余血清;(5)滴加第一抗體(兔抗大鼠pan-Ras多克隆抗體，工作濃度1∶100;或兔抗大鼠c-fos多克隆抗體，工作濃度 1∶100)，置濕盒內(nèi) 4℃冰箱過夜。PBS洗3×5min;(6)滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(S-P試劑盒C試劑，工作濃度1∶500)置濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育30min。PBS洗3×5min;(7)滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素(S-P試劑盒D試劑，工作濃度 1∶500)，室溫下孵育 30min。PBS洗3×5min;(8)切片DAB顯色5min，流水充分沖洗;(9)蘇木素復(fù)染1min，分化、返藍(lán);(10)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固、光鏡觀察。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，其余步驟相同。

2.3.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 細(xì)胞染色呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)定性處理［2］，陰性(－):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%;陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%。以大鼠肺組織細(xì)胞胞漿胞核染色強(qiáng)度高于背景非特異染色并5%以上為陽(yáng)性。細(xì)胞不著色與背景一致為陰性。

半定量處理，運(yùn)用OLYMPUS BX51型顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，用Image pro plus6.0(美國(guó) Media Cybernetics公司)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，測(cè)定 pan-Ras及c-fos蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度(average optical density，AOD)。AOD=累計(jì)光密度(IOD)/(圖像面積-組織空白區(qū)面積)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400)，計(jì)算其 AOD的均值，作為該切片的代表值，反應(yīng)其陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織病理變化

石蠟切片HE染色鏡下觀察示，空白組大鼠僅偶見極少量炎性細(xì)胞，但未見嗜酸性粒細(xì)胞，支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常。哮喘模型組大鼠氣道周圍有嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集，可見支氣管平滑肌痙攣、管腔狹窄及氣道黏膜下組織水腫等病理改變。針刺組大鼠氣道周圍仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但與模型組比較則明顯減輕;氣管平滑肌痙攣，管腔狹窄有不同程度的好轉(zhuǎn)(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE×400)

3.2 各組大鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果

3.2.1 各組免疫組化結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示，pan-Ras陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，主要位于細(xì)胞漿中。pan-Ras在空白組偶見，陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%);哮喘模型組表達(dá)增加，可見大量陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，主要分布在氣管黏膜部位(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%);針刺組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較哮喘模型組明顯減少，但仍較空白組顯著，呈陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%)。c-fos細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒樣?？瞻捉M和針刺組表達(dá)很少，呈陰性表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%)。哮喘模型組表達(dá)良好，呈陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%)(圖2、3)。

圖2 pan-Ras大鼠肺組織中的表達(dá)(免疫組化×400)

圖3 c-fos大鼠肺組織中的表達(dá)(免疫組化×400)

3.2.2 各組大鼠肺組織 pan-Ras及c-fos蛋白陽(yáng)性表達(dá)的AOD值 表1顯示，pan-Ras陽(yáng)性表達(dá)AOD值比較，哮喘模型組明顯高于空白組(F=0.022，P=0.000＜0.05);針刺組亦高于空白組(F=0.013，P=0.008＜0.05);且針刺組陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度值低于哮喘模型組(F=0.009，P=0.046＜0.05)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。c-fos陽(yáng)性表達(dá)AOD值比較，哮喘模型組高于空白組及針刺組(F=0.007，P=0.000;F=0.005，P=0.002 ＜ 0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;針刺組與空白組比較，其陽(yáng)性表達(dá)值雖高于空白組，但二者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.002，P=0.169 ＞0.05)。

表1 各組大鼠肺組織pan-Ras及c-fos蛋白陽(yáng)性表達(dá)AOD值的比較(±s)

表1 各組大鼠肺組織pan-Ras及c-fos蛋白陽(yáng)性表達(dá)AOD值的比較(±s)

注:與空白組比較:△P＜0.05;與哮喘模型組比較:▲P＜0.05

組別 例數(shù)pan-Ras c-fos空 白 組10 0.022 8±0.006 6 0.004 9±0.003 5哮 喘 模 型 組 10 0.044 8±0.013 9△ 0.011 3±0.003 6△哮喘模型針刺組 10 0.035 5±0.007 8△▲ 0.006 1±0.004 7▲

4 討論

Ras-MAPK通路是目前為止研究得最為透徹的一條，其信號(hào)傳導(dǎo)過程一般包括細(xì)胞外信號(hào)/酪氨酸蛋白激酶受體(RPTK/RTK)/Ras/Raf/MAPKK(MEK1/2)/MAPK/c-fos。整個(gè) Ras-MAPK信號(hào)通路在胚胎的發(fā)育，細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等生物學(xué)過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用［3］。Ras蛋白是這一通路的分子開關(guān)，在細(xì)胞增殖分化信號(hào)從激活的跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶的過程中起重要作用［4］。其過度表達(dá)能促使這一過程轉(zhuǎn)化。有文獻(xiàn)報(bào)道，哮喘豚鼠的Ras蛋白表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，提示與哮喘氣道重塑有著密切聯(lián)系［5］。c-fos原癌基因位于人類常染色基因 14q24.3-q31上，是 Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)下游核心元件ERK的底物之一。其蛋白產(chǎn)物與c-jun蛋白組成穩(wěn)定的異二聚體活性蛋白-1(AP-1)，屬于轉(zhuǎn)錄因子，后者可與 DNA分子特異順序AP-1位點(diǎn)結(jié)合來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。c-fos在多數(shù)正常細(xì)胞中顯有表達(dá)，但它可受多種炎癥介質(zhì)、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子激活，激活后可參與哮喘的病理過程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子可通過肌醇脂質(zhì)信使系統(tǒng)作用以及通過酪氨酸蛋白激酶活化 MAPK，促進(jìn) c-fos表達(dá)，從而刺激氣道平滑肌的增生［6］。此外，c-fos表達(dá)增高還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，阻斷糖皮質(zhì)激素及其受體對(duì)某些基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)，進(jìn)一步加重哮喘的發(fā)生［7］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哮喘模型組HE染色鏡下觀察，炎癥病理改變明顯;經(jīng)針刺干預(yù)后，炎癥反應(yīng)明顯減輕，但仍未達(dá)到正常組水平。哮喘模型組肺組織中，與Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路密切相關(guān)的pan-Ras、c-fos蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05);針刺后pan-Ras、c-fos蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，c-fos蛋白表達(dá)降低至與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以上說明，針刺具有良好的抗炎作用，能有效緩解大鼠哮喘發(fā)作，其治療作用可能與抑制Ras-MAPK途徑的激活有關(guān)。細(xì)胞外針刺刺激，能明顯抑制Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路上主要蛋白pan-Ras、c-fos的表達(dá)，進(jìn)而抑制 Ras-MAPK途徑的激活，發(fā)揮抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖、降低炎癥反應(yīng)的作用。至于針刺與Ras-MAPK途徑上游跨膜受體之間的關(guān)系，它通過影響何種配體來與膜受體結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，它與該途徑下游其他分子之間的關(guān)系等問題，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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