張 虎,杜欣娜,張淑紅,朱金玲,李春明,趙 璐,胡新俊
(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯154007;2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154002;3.佳木斯中心醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154002)
干擾素(Interferon,IFN)主要是糖蛋白,功能多樣,具有免疫活性。干擾素在抗病毒、增強(qiáng)免疫力和治療腫瘤方面作用巨大。一直以來干擾素一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。但是在臨床上,干擾素的不足之處在于半衰期短,且容易產(chǎn)生副作用。尋找合適的干擾素誘導(dǎo)劑成為了當(dāng)今研究的焦點(diǎn)[1]。本課題研究了新鮮香菇dsRNA對(duì)于小鼠肝臟細(xì)胞的干擾素-α的表達(dá)影響,初步探討其中的機(jī)制,為尋找合適的干擾素誘導(dǎo)劑提供前期基礎(chǔ)。
佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供小鼠30只,體重(20±4)g,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。新鮮香菇購(gòu)買于佳木斯市大潤(rùn)發(fā)超市。
1.2.1 DsRNA的提取和鑒定
[2,3],取新鮮香菇10g,液氮研磨,加入2倍體積的STE及酚/氯仿/異戊醇混合液抽提;2000rpm離心;取上清液,加入無水乙醇至終濃度的17%,注入預(yù)處理過的纖維素(CF-Ⅱ)柱中,最后用80mL含17%乙醇的1倍體積的STE液洗脫,再用不含乙醇的1倍體積的STE液洗脫;洗脫液用異丙醇、乙醇沉淀,真空抽干,得到dsRNA。
1.2.2 RT-PCR檢測(cè)干擾素-αmRNA的表達(dá)變化
1.2.2.1 動(dòng)物處理
對(duì)照組小鼠不做任何處理,實(shí)驗(yàn)組小鼠分為dsRNA注射0.5、5和50mg·kg-1三個(gè)組,12h后猝死所有小鼠,取肝臟,液氮保存,備用。
1.2.2.2 小鼠肝臟總RNA提取
TRIZOL法提取總RNA,操作步驟完全按照Invitrogen公司的說明書進(jìn)行。
1.2.2.3 RT-PCR檢測(cè)干擾素-αmRNA的表達(dá)
① 反轉(zhuǎn)錄:依據(jù)試劑盒說明書20μL反應(yīng)體系:
總RNA:2μg;10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液:2μL;100mM dNTP:0.8μL;10×反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物:2μL;50u/μL反轉(zhuǎn)錄酶:1μL;40u/μL RNA酶抑制劑:0.5μL;DEPC處理過的去離子水:補(bǔ)至20μL。
反轉(zhuǎn)錄條件:25℃10min,37℃120min,85℃5sec,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA-20℃保存待用。
②PCR擴(kuò)增:IFN-α引物序列:上游5'CTGTGCTTTCCTGATGGT 3',下游5'GAGTCTAGGAGGGTTGTATT 3',產(chǎn)物大?。?09bp;
GAPDH引物序列:
上游5’GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3’,
下游5’AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC 3’,產(chǎn)物大?。?00bp。
PCR反應(yīng)體系(20μL):cDNA:1μL;2×Mix液:10μL;F P:0.5μL;R P:0.5μL;無菌雙蒸水:補(bǔ)至20μL
PCR反應(yīng)條件:
95℃5min,95℃30sec,56℃30sec,72℃50sec,28個(gè)循環(huán),72℃5min.
實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),計(jì)量資料以±s表示,P<0.05表示差異具顯著。
表1 不同組間干擾素-αmRNA表達(dá)變化(n=6,±s)
表1 不同組間干擾素-αmRNA表達(dá)變化(n=6,±s)
注:*P<0.01vs對(duì)照組;#P<0.01vs 0.5mg·kg-1;&P<0.01vs 5mg·kg-1
指 標(biāo) 對(duì)照組 0.5mg·kg-1 5mg·kg-1 50mg·kg-1干擾素-αmRNA 0.34±0.05 0.56±0.08* 0.73±0.11*# 0.61±0.09*&
見表1。
1957年人們首次發(fā)現(xiàn)干擾素,生物學(xué)活性廣泛,具有廣譜的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用,組成了機(jī)體防御的重要部分。IFN-α不能直接清除宿主病毒,而是通過抑制病毒復(fù)制來完成抗病毒作用,所以臨床上一旦停止使用干擾素,往往病情反復(fù),甚至惡化。另外,干擾素容易產(chǎn)生副作用,長(zhǎng)期使用對(duì)患者造成一定傷害。干擾素誘導(dǎo)劑巧妙的解決了這些問題,誘導(dǎo)劑促使機(jī)體本身產(chǎn)生干擾素,副作用不明顯[4,5]。
長(zhǎng)雙鏈RNA(1ong double str anded RNA,dsRNA)具有較好的干擾素誘導(dǎo)活性。目前研究較多的是聚肌胞(Poly I:C),它是一種人工合成的dsRNA,其具有dsRNA的結(jié)構(gòu)特性,在抗病毒和抗腫瘤的研究中應(yīng)用較多。細(xì)胞膜的表面和胞漿內(nèi)含有多種dsRNA的識(shí)別受體,dsRNA可以通過不同的細(xì)胞信號(hào)途徑來激活機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答。這其中,比較最重要的是TLR3途徑和RNA解旋酶RIG-I/MDA5途徑[6,7]。本實(shí)驗(yàn)提取新鮮香菇天然dsRNA,以不同濃度作用于小鼠,RT-PCR檢測(cè)了肝臟細(xì)胞內(nèi)IFN-α的表達(dá)情況,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組干擾素-αmRNA較對(duì)照組表達(dá)均顯著升高 (P<0.01,P<0.01,P<0.01),且濃度為5mg·kg-1dsRNA組干擾素-αmRNA的升高最顯著(P<0.01,P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)說明香菇天然dsRNA可以誘使小鼠肝細(xì)胞干擾素-αmRNA表達(dá)增加。dsRNA可以誘導(dǎo)干擾素生成這一發(fā)現(xiàn)為中藥抗病毒機(jī)制研究提供了一條新思路。中藥抗病毒作用機(jī)制往往不為西方醫(yī)藥界所認(rèn)可,原因是中藥有效單體成分不明確。目前中藥抗病毒研究較多的成分是多糖。本研究提示dsRNA可能是中藥抗病毒的 又 一 有 效 成 分。2006 年,RNAi(RNA interference,RNAi)技術(shù)獲得了諾貝爾獎(jiǎng),小片段dsRNA可以與特定基因互補(bǔ),特異性地降低或者關(guān)閉這基因表達(dá)。然而,同為dsRNA,卻可以一方面關(guān)閉基因的表達(dá)(RNAi),另一方面還可以誘導(dǎo)基因的表達(dá)(干擾素的生成),這似乎產(chǎn)生了一對(duì)“矛盾”,其中的機(jī)制未見有人闡述[1]。此外,天然dsRNA的來源、濃度、大小等對(duì)于哺乳動(dòng)物不同組織、細(xì)胞的誘導(dǎo)作用的影響有待于進(jìn)一步研究。天然長(zhǎng)dsRNA如何進(jìn)入細(xì)胞、細(xì)胞核以及如何誘導(dǎo)基因表達(dá)不是很明確,仍需要深入研究。
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