基于HPLC對(duì)不同產(chǎn)地枸杞子中甜菜堿含量的研究△

楊宗學(xué)，林楠，藺海明*，張巨瓊

(1.甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

基于HPLC對(duì)不同產(chǎn)地枸杞子中甜菜堿含量的研究△

楊宗學(xué)1，林楠2，藺海明2*，張巨瓊2

(1.甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

目的：比較不同枸杞子中甜菜堿的含量并評(píng)價(jià)永登縣上川鎮(zhèn)產(chǎn)的枸杞質(zhì)量。方法：采用HPLC對(duì)9個(gè)不同樣品枸杞進(jìn)行甜菜堿含量測(cè)定。采用NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),流動(dòng)相為乙腈-水(95∶0.5)、流速為0.6 mL·min-1、檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：永登縣上川鎮(zhèn)產(chǎn)的枸杞子中甜菜堿含量為0.432 5%，處較高水平。結(jié)論：HPLC測(cè)定甜菜堿含量準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好；永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子中甜菜堿含量高，在該地區(qū)培育出優(yōu)質(zhì)枸杞是可行的。

HPLC；不同產(chǎn)地；枸杞；甜菜堿；含量

枸杞LyciumbarbarumL.是茄科枸杞屬灌木植物，富含的多糖、氨基酸及生物堿等多種成分使其具有豐富的藥理作用。甜菜堿(betaine)作為枸杞中的一種重要成分，在體內(nèi)起甲基供應(yīng)體的作用，可以抗脂肪肝[1-2]。前人已有很多關(guān)于枸杞子甜菜堿的研究，其中有研究認(rèn)為NH2柱未經(jīng)衍生高效液相色譜法所測(cè)甜菜堿含量明顯高于分光光度法[3]；亦有研究認(rèn)為HPLC測(cè)定枸杞子甜菜堿含量靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為枸杞子中甜菜堿的定量測(cè)定方法[4]；同時(shí)有人在對(duì)枸杞的高效液相色譜指紋圖譜的研究中指出用于枸杞質(zhì)量控制的液相色譜指紋圖譜對(duì)提取方法具有很強(qiáng)的依賴性，用枸杞甜菜堿提取液的液相色譜指紋圖譜對(duì)品種進(jìn)行識(shí)別效果較好[5]；另外還有一些研究提出了其他多種甜菜堿的提取和含量測(cè)定方法[6-10]，這些研究對(duì)枸杞子中甜菜堿的提取及含量測(cè)定有著重要意義。但目前尚無(wú)以應(yīng)用日益廣泛、測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確的HPLC對(duì)跨省區(qū)、多品種的枸杞子進(jìn)行甜菜堿含量的測(cè)定和比較。作者以甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)生產(chǎn)的枸杞子為主體，通過(guò)HPLC對(duì)不同產(chǎn)地、不同品種枸杞子的甜菜堿含量進(jìn)行測(cè)定并對(duì)比，以期為進(jìn)一步完善HPLC測(cè)定甜菜堿的色譜分析條件提供參考，同時(shí)對(duì)甘肅省永登縣秦王川地區(qū)枸杞的栽培和品質(zhì)的評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究用的材料均為2011年8月分別采自寧夏農(nóng)科院枸杞觀光園、寧夏中寧縣舟塔鄉(xiāng)、寧夏平羅縣頭閘鎮(zhèn)、甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)、甘肅靖遠(yuǎn)縣東升鄉(xiāng)、甘肅省玉門(mén)市玉門(mén)鎮(zhèn)、甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)、青海省諾木洪農(nóng)場(chǎng)和甘肅永登縣上川鎮(zhèn)的同一批次枸杞子。其中寧夏3份，甘肅5份，青海1份，品種除甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)的為“蒙杞1號(hào)”、青海省諾木洪農(nóng)場(chǎng)的為“柴杞”外，其余7份均為“寧杞1號(hào)”。

1.2 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，島津SPD-M20A二極陣列管檢測(cè)器，LC-solution色譜工作站，NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，PL303-IC梅特勒電子天平，恒溫水浴鍋，無(wú)水甲醇，超純水，乙腈。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備[11]

精密稱(chēng)取枸杞子粉末2.000 g，加入無(wú)水甲醇50 mL，80 ℃回流提取1 h，放至室溫，過(guò)濾，用30 mL甲醇分次洗滌濾渣和濾器，合并濾液，40 ℃下減壓濃縮，水溶解定容至10 mL，備用。在色譜分析前，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，并根據(jù)需要做濃度處理。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取甜菜堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，水溶解定容，得到濃度為0.12 mg·mL-1的溶液，備用。

2.3 線性關(guān)系考察

分別取對(duì)照品溶液2.5,5,7.5,10,12.5,15 μL注入色譜儀，按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行色譜分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得線性方程Y=136 914X+8 786.3，r=0.999 4，表明進(jìn)樣量在0.3～1.8 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.12 mg·mL-1的對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行色譜分析，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.80%，表明精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取1號(hào)樣品供試液10 μL，于0,2,6,12,24 h后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取1號(hào)枸杞子樣品，制備5分供試液，分別取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD=1.29%，表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn) 取已知甜菜堿含量的供試液，加適量的對(duì)照品溶液，取10 μL進(jìn)樣(n=6)，測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.45%，RSD%=2.32%。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件及典型色譜圖

圖1 甜菜堿對(duì)照品和枸杞子供試樣品HPLC圖

通過(guò)試驗(yàn)對(duì)波長(zhǎng)、流速、流動(dòng)相的配比等進(jìn)行摸索，最終確定在NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、乙腈-水(95∶0.5)、流速0.6 mL·min-1、檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL的條件下色譜分析效果良好。對(duì)照品及樣品甜菜堿色譜圖如圖1所示。樣品的色譜圖中，甜菜堿峰型明顯，在5 min左右出現(xiàn)，其中1號(hào)樣品為甘肅省永登縣甘露池村所產(chǎn)枸杞子，甜菜堿峰面積分值為317 079，3號(hào)樣品即寧夏中寧縣舟塔鄉(xiāng)枸杞子樣品的峰面積分值最高，為425 750；各樣品間色譜圖呈現(xiàn)出不同程度的差異，產(chǎn)地不同的同品種枸杞子1號(hào)和3號(hào)、6號(hào)和7號(hào)色譜峰特征性分別相似(如圖1中B、D、G、H所示)，而2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)則各有特點(diǎn)，差異較大；不同品種枸杞子的色譜峰亦有差異，8號(hào)、9號(hào)色譜峰與其他樣品均呈現(xiàn)較大差異(如圖1中I、J所示)，證明樣品色譜圖的相似度由產(chǎn)地條件和樣品品種共同決定，不同樣品其化學(xué)成分含量有差異。

3.2 不同枸杞子甜菜堿含量的比較

通過(guò)對(duì)9個(gè)樣品的甜菜堿峰面積進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而計(jì)算出各樣品甜菜堿含量，最高為0.588 0%，最低為0.300 4%，均大于0.300 0%，達(dá)到《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)9個(gè)樣品含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，不同枸杞子甜菜堿含量存在差異,見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地枸杞子甜菜堿含量比較

注：不同小寫(xiě)字母表示該指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

由表1可以看出，甘肅永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子的甜菜堿含量為0.432 5%，在所有供試樣品中列第3位，處于較高水平；對(duì)不同產(chǎn)地的枸杞子樣品進(jìn)行品種內(nèi)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的同一品種枸杞子，甜菜堿含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中寧夏所產(chǎn)枸杞子除平羅縣頭閘鎮(zhèn)樣品外，甜菜堿含量均較高，整體處于優(yōu)勢(shì)地位，其中就包括最高的中寧縣舟塔鄉(xiāng)所產(chǎn)枸杞子，甜菜堿含量為0.588 0%；此外對(duì)不同品種的枸杞子進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，品種不同甜菜堿含量差異明顯，其中甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)所產(chǎn)“蒙杞1號(hào)”枸杞子，甜菜堿含量為0.404 5%，處于中等偏上水平，而青海諾木洪農(nóng)場(chǎng)的“柴杞”則含量較低。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

供試樣品枸杞子的色譜圖呈現(xiàn)不同程度的差異，同品種枸杞子中亦有較多色譜圖相似度較差，證明產(chǎn)地條件對(duì)枸杞子甜菜堿色譜圖的特征性有影響。

9個(gè)不同枸杞子樣品中甜菜堿含量有明顯差異，其中同品種“寧杞1號(hào)”枸杞甜菜堿含量從0.300 4%到0.588 0%不等，而部分“寧杞1號(hào)”枸杞子與“蒙杞1號(hào)”、“柴杞”甜菜堿含量差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明同一枸杞子品種產(chǎn)地不同其甜菜堿含量有差異、不同枸杞子品種間甜菜堿含量也存在不同程度的差異，產(chǎn)地條件與品種因素對(duì)甜菜堿含量都有影響，這與前人部分研究結(jié)論一致[13]。

4.2 討論

在進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定時(shí)，曾選用C18色譜柱[12]，但效果較差，分析其原因可能是由于甜菜堿為季胺型水溶性生物堿，極性較大所致，故選擇NH2色譜柱，結(jié)果分離效果良好；實(shí)驗(yàn)中還分別在檢測(cè)波長(zhǎng)195，210，230 nm下進(jìn)行色譜分析，結(jié)果在230 nm下各組分色譜峰均有較大吸收。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步肯定了HPLC在測(cè)定枸杞子甜菜堿含量方面準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢(shì)[3-4,14]；研究主體甘肅永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子的甜菜堿含量在9個(gè)樣品中處第3位，就甜菜堿這一藥用成分而言品質(zhì)較優(yōu)，這一結(jié)果有助于日后在甘肅省秦王川地區(qū)繼續(xù)開(kāi)展枸杞的栽培與選育工作。

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StudyonDeterminationofBetaineinLyciiFructusfromDifferentHabitatsbyHPLC

YANG Zong-xue1,LIN Nan2，LIN Hai-ming2*,ZHANG Ju-qiong2

(1.ServiceCenterofAgriculturalScienceandTechnologyofYongdengCounty,Lanzhou730030，China； 2.GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070，China)

Objective： To compare the betaine content in Lycii Fructus from different habitats and evaluate the quality ofLyciumbarbarumfrom Shangchuan town,Yongdeng county.Methods： Use HPLC to determine betaine content of 9 different samples. NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm) chromatographic column,acetonitrile： water (95∶0.5),the flow rate was 0.6 mL·min-1,the detective wavelength was 230 nm,the temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.Results： The betaine content in Lycii Fructus from Shangchuan town is 0.432 5%,this is a high level.Conclusion： The HPLC method is precise and reproducible,betaine content in Lycii Fructus from Shangchuan town is high,it is possible to yield good quality ofLyciumbarbarumat Shangchuan town.

HPLC ； Habitat； Lycii Fructus； Betaine

2012-11-04)

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蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010-1-236)

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藺海明，E-mail：linhm@gsau.edu.cn