IHC和FISH聯(lián)合檢測(cè)164例乳腺癌中Her-2表達(dá)的臨床意義

周慶云，趙 潔，田 芳，王東存，孫建平

(甘肅省婦幼保健院，蘭州 730030)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前研究證實(shí)［1］:人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)在25%～30%的原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌中有基因擴(kuò)增和蛋白的過度表達(dá)。對(duì)一般化療方案無效，腫瘤易早期復(fù)發(fā)且患者生存期縮短，靶向治療藥物赫賽汀(Herceptin)自問世并成功用于臨床，已使很多Her-2高表達(dá)的患者受益，這提示準(zhǔn)確測(cè)定Her-2基因狀態(tài)至關(guān)重要。目前臨床檢測(cè)Her-2方法有兩種:一是檢測(cè)Her-2蛋白的免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical method，IHC)，另一種是檢測(cè)Her-2基因的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，相輔相成，美國(guó)FDA承認(rèn)用FISH技術(shù)檢測(cè)出Her-2基因的擴(kuò)增為能進(jìn)行Herceptin治療的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。我們應(yīng)用FISH和IHC聯(lián)合檢測(cè)乳腺癌患者Her-2基因及Her-2蛋白表達(dá)，分析二者之間的差異性和一致性，為乳腺癌患者個(gè)體化治療方案的設(shè)計(jì)及其預(yù)后的評(píng)價(jià)提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我院2010年10月至2013年7月乳腺癌標(biāo)本164例，患者均為女性，年齡23～82歲，平均47.5年齡，術(shù)前均未接受放療、化療。所有標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋。其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌149例，浸潤(rùn)性小葉癌3例，髄樣癌2例，黏液癌4例，小管癌3例，微乳頭狀癌2例，篩狀癌1例。

1.2 方法 用FISH和IHC法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本中的Her-2基因擴(kuò)增和Her-2蛋白表達(dá)。

1.2.1 熒光原位雜交技術(shù) GLP Her-2/CSP17探針試劑盒(購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)，切片厚度3μm，烤片2 h，室溫下脫蠟，90℃水浴鍋水化20 min，70%乙醇洗后晾干，蛋白酶K 37℃消化，2×SCC 3 min，4%甲醛固定10 min，2×SCC 3 min，梯度乙醇(75%，85%，100%)脫水各3 min，晾干后加探針2μl+8μl，雜交儀 83℃變性，40℃雜交過夜，46℃ ±1℃水浴鍋內(nèi)(2×SCC 7 min，2×SCC 10 min，0.1%NP-40/2 ×SCC 10 min)，70%乙醇提洗3 min，自然晾干后加DAPI復(fù)染液(4℃冰箱放置10 min)，蓋玻片封片后熒光顯微鏡選擇合適通道觀察。

1.2.2 免疫組化技術(shù) 免疫組化單克隆抗體即用型非生物素免疫組化MaxVision TM快速法檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。切片厚度3μm，常規(guī)烤片、脫蠟入純水。組織切片放入pH 6.0的檸檬酸緩沖液中，高壓抗原修復(fù)，用 PBS(pH7.4)充分洗滌后加入一抗4oC冰箱過夜，PBS充分洗片，切片滴加即用型MaxVision TM試劑，室溫孵育15 min。洗滌后加DAB顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，封片。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 FISH 在40×物鏡下觀察信號(hào)，選擇細(xì)胞核孤立無重疊，大小一致、核膜完整，綠信號(hào)清晰區(qū)域，在100×物鏡下，通過特異的單通道濾光片隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。統(tǒng)計(jì)Ratio值(Ratio值=30個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/30個(gè)細(xì)胞核中綠信號(hào)總數(shù))。Ratio＜1.8為陰性結(jié)果，提示樣本中無Her-2基因擴(kuò)增;Ratio＞2.2為陽(yáng)性結(jié)果，提示樣本中Her-2基因擴(kuò)增，若兩種信號(hào)的比值＞20或眾多信號(hào)連接呈簇時(shí)，可不用計(jì)算，即視為基因擴(kuò)增;Ratio在1.8～2.2之間時(shí)，可以選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞至100個(gè)，或重做FISH實(shí)驗(yàn)來判斷最終結(jié)果。

1.3.2 IHC 參照美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)院Her-2檢測(cè)指南評(píng)分系統(tǒng)［3］:浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞無著色為陰性(-)，瘤細(xì)胞呈弱且不完整的胞膜著色或＜10% 瘤細(xì)胞呈較弱的胞膜染色為弱陽(yáng)性(+)，≥10% 瘤細(xì)胞有較弱但完整的胞膜著色或≤30%瘤細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的胞膜著色為陽(yáng)性(++)，＞30%瘤細(xì)胞呈較強(qiáng)的完整的胞膜著色為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。FISH和IHC檢測(cè)結(jié)果采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)比較差異性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用Kappa檢驗(yàn)分析兩者的一致性。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中Her-2基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)(表1)164例浸潤(rùn)性乳腺癌中，F(xiàn)ISH檢測(cè)Her-2基因擴(kuò)增53例，陽(yáng)性率為31.70%;按乳腺癌Her-2檢測(cè)指南，IHC檢測(cè)(-)和(+)為陰性結(jié)果，(++)和(+++)為陽(yáng)性結(jié)果，本組IHC檢測(cè)Her-2蛋白陽(yáng)性(++～+++)137例，陽(yáng)性率為83.53%。Her-2蛋白檢出率明顯高于Her-2基因擴(kuò)增，兩者陽(yáng)性率有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 IHC法與 FISH法檢測(cè)Her-2表達(dá)的相關(guān)性(表1和表2) 本組IHC檢測(cè)Her-2蛋白陰性(-/+)共27例中有26例無基因擴(kuò)增，96例(++)中有21例基因擴(kuò)增，41例(+++)中有30例基因擴(kuò)增，3組中 IHC和 FISH符合率分別為96.29%、21.87%、73.17%。本組結(jié)果顯示 IHC檢測(cè) 27例Her-2蛋白陰性(-/+)的患者和41例(+++)病例與Her-2基因擴(kuò)增一致性較好(K=0.653，P＜0.05)。IHC檢測(cè)96例Her-2蛋白(++)病例中只有21例基因擴(kuò)增，符合率為21.87%;41例(+++)中有30例基因擴(kuò)增，符合率為73.17%。兩種方法檢測(cè)Her-2基因是否擴(kuò)增(陰/陽(yáng)性率比較)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);以 IHC方法檢測(cè)Her-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率較高;兩種檢測(cè)方法的吻合度一般(Kappa=0.479，P＜0.05)。

表1 Her-2蛋白表達(dá)水平與Her-2基因擴(kuò)增情況［n(%)］

表2 IHC(++)和(+++)與FISH檢驗(yàn)結(jié)果比較［n(%)］

3 討論

Her-2基因(又稱Her-2/neu或Her-2基因)是人類原癌基因，定位于人染色體17q21。在乳腺癌的發(fā)病、發(fā)展、預(yù)后和選擇使用Herceptin生物靶向治療中有重要意義，Her-2基因過表達(dá)的乳腺癌患者其癌細(xì)胞侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)化療耐受，對(duì)內(nèi)分泌治療效果也不理想，其預(yù)后也較差［4］。2002年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了分子靶向藥物Herceptin在臨床治療中的應(yīng)用，它對(duì)于乳腺癌中具有Her-2基因擴(kuò)增的患者具有良好的治療效果，可以大大提高其生存期，而對(duì)Her-2基因無擴(kuò)增患者治療則是無效的。且其費(fèi)用昂貴，又存在心血管疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)［5］。因而無論是臨床醫(yī)生還是患者對(duì)于該藥物的選擇都非常慎重。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)Her-2基因及其蛋白表達(dá)顯得極為關(guān)鍵。

目前，臨床診斷常用IHC檢測(cè)Her-2蛋白和FISH檢測(cè)Her-2基因兩種方法。IHC由于操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可重復(fù)性好，對(duì)標(biāo)本要求不高，因此在臨床上被廣泛應(yīng)用。但其定量性不強(qiáng)，從組織固定、抗原修復(fù)、染色切片、判讀、不同批號(hào)抗體之間的差異等都影響檢測(cè)結(jié)果，17號(hào)染色體的非整倍體還會(huì)使檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性［6］。FISH方法因其高度敏感性和特異性及高度重復(fù)性和可靠性在Her-2基因檢測(cè)中被當(dāng)作金標(biāo)準(zhǔn)用于Her-2基因檢測(cè)。但FISH結(jié)果也會(huì)受到一些因素的影響，如標(biāo)本固定時(shí)間長(zhǎng)，烤片溫度過高，蛋白消化不當(dāng)，變性溫度差異等，都會(huì)造成熒光信號(hào)減弱或無信號(hào)。鑒于上述這些影響因素，對(duì)IHC和FISH檢測(cè)Her-2狀態(tài)一致性的研究具有重要的臨床意義。

本研究中，27例IHC陰性的病例中，F(xiàn)ISH呈陰性者占96.29%(26/27)，兩者結(jié)果具有較高一致性。既往研究發(fā)現(xiàn)［7］IHC-/+的病理與FISH檢測(cè)的符合率可達(dá)95%以上，與本研究結(jié)果一致。但在96例IHC(++)患者中，F(xiàn)ISH呈陽(yáng)性者只占21.87%(21/96)，提示與FISH檢測(cè)結(jié)果的一致性較差，被認(rèn)為不確定的結(jié)果，與文獻(xiàn)報(bào)道［8］IHC(++)的乳腺癌FISH陽(yáng)性10% ～25%的結(jié)果一致。本研究中IHC檢測(cè)Her-2蛋白表達(dá)(+++)者中只有73.17%表現(xiàn)為 Her-2基因擴(kuò)增，與既往研究［9-10］IHC(+++)的病例與FISH檢測(cè)陽(yáng)性的符合率達(dá)90%以上國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道有一定差距。而與國(guó)內(nèi)王曉蘭等［11］報(bào)道的68%的檢測(cè)符合率相近，依據(jù)上述結(jié)果提示IHC與FISH兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在較大的差異。Her-2蛋白表達(dá)為(++/+++)的樣本中，仍然有一部分表現(xiàn)為Her-2基因無擴(kuò)增。

有研究表明，對(duì)于FISH檢測(cè)陽(yáng)性患者，IHC檢測(cè)陰性患者，其Herceptin治療后的生存是與FISH檢測(cè)陽(yáng)性、IHC檢測(cè)陽(yáng)性患者的生存期一致，而FISH法檢測(cè)陰性、IHC檢測(cè)陽(yáng)性患者，治療后的生存與FISH法檢測(cè)陰性、IHC檢測(cè)陰性患者的生存期一致。這說明IHC檢測(cè)存在假陽(yáng)性，目前研究認(rèn)為主要與17號(hào)染色體非整倍體有關(guān)［12］。本組研究IHC(++)患者中，F(xiàn)ISH呈陽(yáng)性者只占21.87%，是否因與17號(hào)染色體非整倍體有關(guān)出現(xiàn)了假陽(yáng)性，或是因?qū)嶒?yàn)流程，檢測(cè)結(jié)果質(zhì)控欠規(guī)范，造成IHC與FISH兩種方法的檢測(cè)結(jié)果存在較大的差異，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，采用IHC檢測(cè)Her-2蛋白表達(dá)時(shí)，可作為臨床治療是否應(yīng)用Herceptin的初篩。初篩結(jié)果中IHC(-/+)的病例Her-2基因幾乎無擴(kuò)增，而無需再做FISH檢測(cè)。而Her-2蛋白表達(dá)為(++)時(shí)，有必要進(jìn)一步進(jìn)行Her-2基因擴(kuò)增的檢測(cè)，Her-2蛋白表達(dá)為(+++)時(shí)可建議進(jìn)行Her-2基因擴(kuò)增的檢測(cè)，來確定臨床治療是否應(yīng)用Herceptin，為患者分子靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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